王蕊，馬克濤，司軍強(qiáng)，2，3，張傳林，李麗

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002；2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢430071；3華中科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢430071）

縫隙連接（gap junction，GJ）是細(xì)胞間能直接進(jìn)行物質(zhì)和信息交換的通道［1］。其具有高通透性和非選擇性，允許相對(duì)分子量小于1000的物質(zhì)（包括第二信使Ca2＋、IP3）及電流等通過(guò)［2］。在調(diào)節(jié)血管舒縮、血管平滑肌細(xì)胞增殖和平滑肌的表型轉(zhuǎn)變中起著重要作用，并與高血壓發(fā)生密切相關(guān)［3－4］。GJ在腦血管上對(duì)血管壁細(xì)胞間的信息傳遞起著重要作用，這對(duì)于直徑小的阻力血管具有更重要的意義［4］。18β甘草次酸（18β－Glycyrrhetintic Acid，18βGA）是中藥甘草的主要活性成分，也是一種強(qiáng)效的非選擇性的縫隙連接阻斷劑，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究。在微動(dòng)脈血管，18βGA能非選擇性地抑制平滑肌細(xì)胞間、內(nèi)皮細(xì)胞間以及肌內(nèi)皮之間的縫隙連接（gap junction，GJ）［5］。

本研究應(yīng)用壓力肌動(dòng)圖技術(shù)觀察縫隙連接阻斷劑18βGA對(duì)Wistar大鼠腦中動(dòng)脈的收縮活動(dòng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用Wistar大鼠（購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)SCXK新2003－0001）。體重在200～300g，雌雄不拘，清潔級(jí)。

1.2 溶液制備

生理鹽溶液（Physiological Saline Solution，PSS）成分 （mmol／L）NaCl 119，KCl 4.69，MgSO4·7H2O 1.17，KH2PO41.18，CaCl22.5，NaHCO225，EDTA 0.026，葡萄糖5.5。將pH調(diào)至7.4。

K－PSS液成分（mmol／L）KCl 123.70，MgSO4·7H2O 1.17，KH2PO4 1.18，CaCl22.5，NaHCO225，EDTA 0.026，葡萄糖5.5。

1.3 腦中動(dòng)脈標(biāo)本制備

在麻醉后放血處死，迅速取出腦，置于含有95%O2和5%CO2的4℃飽和PSS液中，清除大腦中動(dòng)脈旁的脂肪和腦膜，剪成2～3mm的血管段備用，在動(dòng)物被處死到固定到記錄系統(tǒng)上在45min內(nèi)完成。

1.4 腦中動(dòng)脈固定及活性檢測(cè)

血管固定在兩個(gè)玻璃微電極上，外徑是125－150μm，用10－0號(hào)眼科尼龍線固定血管在（Pressure myograph system，DMT，110P，Denmark）水浴槽上，浴槽中持續(xù)通以95%O2、5%CO2的混合氣體，管的遠(yuǎn)端封閉，形成一個(gè)無(wú)流動(dòng)實(shí)驗(yàn)的狀態(tài)，任何血管漏氣時(shí)丟棄。DMT由一個(gè)攝像機(jī)和控制系統(tǒng)控制，血管直徑的變化通過(guò)視頻顯微測(cè)量技術(shù)和一個(gè)校準(zhǔn)視頻尺寸分析儀來(lái)分析測(cè)量血管直徑，測(cè)量單位是μm。血管壓力從0mmHg上升到60mmHg，每隔5min上升10mmHg，直到60mmHg［6］。血管的壓力維持在60mmHg，在溫度37°C，pH 7.4的PSS液中孵育1h，每隔20min換一次PSS液。給予K－PSS液檢測(cè)血管的活性，觀察血管的收縮程度大于直徑的1／3，穩(wěn)定后再用10μmol／L乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）舒張，舒張率大于80%認(rèn)為內(nèi)皮完整，可用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)驗(yàn)藥物

18－β 甘 草 次 酸、乙 酰 膽 堿 （Acetylcholine，ACh）購(gòu)自Sigma公司，KCl等其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.6 血管收縮率的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)方法

血管直徑收縮幅度變化公式D（μm）＝DPDX，DP為血管在PSS中穩(wěn)定時(shí)的直徑，DX為血管加入不同濃度的藥物時(shí)血管穩(wěn)定后的直徑，Dmax為血管加入藥物后的直徑收縮幅度最大值；血管收縮率（rate）＝（DP－DX）／Dmax。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（S）表示，組內(nèi)比較用單向（單因素）方差分析（one－Way ANOVA）。組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 KCl濃度依賴性的引起腦中動(dòng)脈收縮

結(jié)果如圖1所示。

圖1 KCl濃度依賴性的引起腦中動(dòng)脈收縮（×100Bar∶70μm）Fig.1 KCl vasoconstriction range in concentrationdependent manner in MCA of rat（×100Bar∶70μm）

PSS液孵育后，給予不同濃度的血管收縮劑KCl（10～80mmol／L），可引起濃度依賴性的血管收縮。KCl濃度為30mmol／L時(shí)可明顯觀察到血管收縮，80mmol／L時(shí)血管直徑收縮接近最大值（圖1a、b）。

10～80mmol／L的KCl引起血管收縮幅度分別為1.6±1.2、5.9±2.5、30.7±7.0、49.2±5.8、64.7±4.1、79.4±4.0、83.8±3.6和84.8±3.7 μm（n＝7）（圖1a、b）。

KCl收縮率曲線呈“S”型（圖3c）。當(dāng)KCl濃度≥30mmol／L時(shí)，血管收縮直徑變化率與PSS液對(duì)照相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，n＝7）。

2.2 18β－GA可濃度依賴性的引起腦中動(dòng)脈收縮

血管孵育完成后，分別向浴槽中加入終濃度為3μmol／L、10μmol／L、30μmol／L 和100μmol／L的18β－GA，血管直徑從248.4±7.4μm（n＝8）分別收縮到240.2±6.7、227.8±8.0、203.1±8.6和161.3±5.6μm，用PSS液沖洗后，血管直徑可恢復(fù)至232.4±7.0μm（圖2a）。圖2b顯示，當(dāng)18β－GA≥10μmol／L時(shí)，與PSS液對(duì)照相比，血管收縮直徑變化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，n＝8）。

圖2 18βGA濃度依賴性的引起腦中動(dòng)脈收縮（×100Bar∶80μm）Fig.2 18βGA vasoconstriction range in concentrationdependent manner in MCA of rat（×100Bar∶80μm）

2.3 18βGA抑制KCl引起的血管收縮

100μmol／L的18βGA預(yù)孵育大腦中動(dòng)脈20 min后，10～80mmol／L的KCl引起的血管收縮幅度分別為5.0±2.4、7.8±4.0、28.6±6.0、51.6±5.4、54.4±5.8、55.9±5.7、56.8±6.2和59.4±6.7μm（圖3a、b）。不同濃度的KCl雖仍能濃度依賴的引起血管收縮，但與未加入18βGA相比，其收縮率曲線在50～80mmol／L之間發(fā)生明顯下移，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，n＝5～7）（圖3c）。孵育18βGA前后KCl引起血管收縮的EC50分別為38 mmol／L和30.7mmol／L，兩者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n＝5～7）（圖3c）。

圖3 18βGA抑制KCl引起的腦中動(dòng)脈血管收縮（×100Bar∶70μm）Fig.3 18βGA suppressed vasoconstriction by KCl in MCA of rat（×100Bar∶70μm）

3 討論

我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：KCl和18βGA可分別濃度依賴性的引起腦動(dòng)脈血管收縮，但用100μmol／L的18βGA孵育血管20min后，KCl引起的血管收縮反應(yīng)被明顯抑制。

眾所周知，鉀離子通道被激活開(kāi)放后，鉀離子外流，引起平滑肌細(xì)胞膜的超極化或舒張。當(dāng)細(xì)胞外的鉀離子濃度增加時(shí)，鉀離子外流減少，引起平滑肌細(xì)胞的去極化，導(dǎo)致血管收縮［7］。阻力血管中平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接通訊參與血管肌張力的調(diào)節(jié)［8］。組成細(xì)胞間縫隙連接蛋白的結(jié)構(gòu)變化或功能受損，使細(xì)胞間通訊發(fā)生障礙，可影響血管細(xì)胞間的同步活動(dòng)，引起血管緊張度發(fā)生改變［4］。已有研究表明5～10μmol／L 18βGA可增加兔小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜輸入電阻，并使部分平滑肌細(xì)胞鈣瞬變?nèi)ネ?，這一結(jié)果與我們實(shí)驗(yàn)室前期在豚鼠腸系膜動(dòng)脈上的結(jié)果一致［9］。Yamamoto等應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)，40μmol／L的18βGA能快速阻斷豚鼠腸系膜微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間的電偶聯(lián)，且在這一濃度時(shí)不會(huì)明顯影響細(xì)胞膜上其他離子通道的功能［10］。Paolo Santicioli等應(yīng)用蔗糖間隙技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在豚鼠的腎盂和輸尿管上，3～30μmol／L的18βGA呈濃度和時(shí)間依賴性的抑制電刺激誘發(fā)的動(dòng)作電位，并減弱電刺激誘發(fā)的血管收縮［11］。而我們的實(shí)驗(yàn)在單獨(dú)給予腦動(dòng)脈血管3～100μmol／L的18βGA呈現(xiàn)濃度依賴性的血管收縮，這些結(jié)果的不同可能是由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬和微動(dòng)脈部位不同造成的。Vladimir V等應(yīng)用張力肌動(dòng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，10～30μmol／L的18βGA呈濃度依賴性的減弱去甲腎上腺素和高鉀誘導(dǎo)的大鼠腸系膜微動(dòng)脈血管的收縮，同時(shí)他們應(yīng)用膜片鉗技術(shù)還發(fā)現(xiàn)，30μmol／L的18βGA明顯增強(qiáng)豚鼠腸系膜微動(dòng)脈單個(gè)平滑肌細(xì)胞外向電流，也抑制鈣離子通道，減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，舒張小動(dòng)脈［9］，表明高濃度的18βGA對(duì)血管平滑肌細(xì)胞可能具有其他非特異性的作用［10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，100μmol／L的18βGA顯著抑制高鉀引起的血管收縮。另外，我們前期的膜片鉗研究也發(fā)現(xiàn)，100μmol／L 18βGA不僅能完全阻斷血管平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接，而且還能增加血管平滑肌細(xì)胞的、四乙胺敏感的外向電流［12］，結(jié)果提示100 μmol／L 18βGA可以激活大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（Large－Conductance Calcium－Activated Potassium Channels，BKCa channel，BKCa）介 導(dǎo) 的 外 向 電流［13］。已知BKCa通道是血管平滑肌細(xì)胞上具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)血管張力的重要的離子通道，BKCa通道激活后，鉀離子外流增加，細(xì)胞膜超極化，從而引起血管舒張［14］，抵消了部分細(xì)胞外高KCl引起的收縮作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的18βGA對(duì)腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞發(fā)揮的作用不同，鑒于18βGA作用的復(fù)雜性，因此不能將18βGA作為單一的縫隙連接阻斷劑。

［1］Alonso P M.Connexin phosphorylation as a regulatory event linked to channel gating［J］.Biochim Biophys Acta，2005，1711（2）：164－171.

［2］Brink P R，Ricotta J，Christ G J.Biophysical characteristics of gap junctions in vascular wall cells：implications for vascular biology and disease.Braz［J］.Med Biolog Res，2000，33（4）：415－422.

［3］Kansui Y，F(xiàn)ujii K，Nakamura K，et al.Angiotensin II receptor blockade corrects altered expression of gap junctions in vascular endothelial cells from hypertensive rats Am［J］.Physiol Heart Circ Physiol，2004，287（1）：216－224.

［4］王恩幫，鐘華，羅小林，等.縫隙連接在同型半胱氨酸介導(dǎo)的高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，29（4）：475－478.

［5］Figueroa X F，Isakson B E，Duling B R.Connexin：Gaps in our knowledge of vascular function［J］.Physiology（Bethesda），2004，19（5）：277－284.

［6］馬克濤，李新芝，李麗，等.18β－甘草次酸抑制微動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞外向電流［J］.生理學(xué)報(bào)，2011，63（6）：549－554.

［7］蔣學(xué)偉，馬克濤，李麗，等.微小動(dòng)脈血管離體標(biāo)本的直徑測(cè)量技術(shù)［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，31（2）：202－205.

［8］Joanne M D，John P B，Philip D L.Potassium does not mimic EDHF in rat mesenteric arteries［J］.British Journal of Pharmacology，2000，130：1174－1182.

［9］Vladimir V M，Awahan Rahman，Christian Aalkj?r Junctional and nonjunctional effects of heptanol and glycyrrhetinic acid derivates in rat mesenteric small arteries［J］.British Journal of Pharmacology，2004，142（6），961－972.

［10］Yoshimichi Yamamoto，Hiroyasu Fukuta，Yoko Nakahira，et al.Blockade by 18β－glycyrrhetinic acid of intercellular electrical coupling in guinea－pig arterioles［J］.Journal of Physiology，1998，511（11）：501－508.

［11］Paolo Santicioli，Carlo A M.Effect of 18β－glycyrrhetinic acid on electromechanical coupling in the guinea－pig renal pelvis and ureter［J］.British Journal of Pharmacology，2000，129：163－169.

［12］Li X Z，Si J Q，Liu Z J，et al.Inhibitory effect of 18βglycyrrhetinic acid on gap junction of vascular smooth muscle cells in guinea pig［J］.Jilin University（Medicine Edition），2011，37（3）：413－417.

［13］陳新燕，馬克濤，李麗，等.18β－甘草次酸對(duì) Wistar大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠腦微動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞縫隙連接的影響［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2013，29（2）：181－184.

［14］李新芝，司軍強(qiáng)，李麗，等.18β－甘草次酸對(duì)豚鼠微動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道的增強(qiáng)作用［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，29（4）：479－482.