張建云，許文博，劉升學(xué)，黃家風(fēng)

（1石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院／新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003；2大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，大連116036）

蠶豆病毒屬（Fabavirus）病毒由多種蚜蟲以非持久性方式傳播，具有廣泛的寄主范圍，對(duì)許多經(jīng)濟(jì)重要的農(nóng)作物及園藝植物造成嚴(yán)重危害［1］。病毒粒體球形，由大、小2種衣殼蛋白組成；基因組由兩條正單鏈 RNA 分子－RNA1（6.0kb）和 RNA2（3.6 kb）組成，采用多聚蛋白翻譯策略。由RNA1編碼的1個(gè)多聚蛋白被進(jìn)一步加工形成5個(gè)功能蛋白，即輔助因子（Co－Pro）、解旋酶（Hel）、蛋白酶（Pro）、基因連鎖蛋白（VPg）和依賴于RNA的RNA聚合酶（Pol）。由RNA2編碼的1個(gè)多聚蛋白被進(jìn)一步加工形成3個(gè)功能蛋白，即運(yùn)動(dòng)蛋白（MP）和2個(gè)衣殼蛋白（LCP和SCP）［2］。

目前認(rèn)為，該屬有4個(gè)種，即蠶豆萎蔫病毒1（Broad bean wilt virus 1，BBWV1）、蠶豆萎蔫病毒2（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）、野芝麻輕花葉病毒（Lamium mild mosaic virus，LMMV）和龍膽花葉病毒（Gentian mosaic virus，GeMV）［3］。而曾經(jīng)報(bào)導(dǎo)的廣藿香輕花葉病毒（Patchouli mild mosaic virus，Pat－MMV）和薇甘菊花葉病毒（mikania micrantha mosaic virus，MMMV）在第9次國(guó)際病毒分類委員會(huì)的報(bào)告中將其分別列為BBWV2的1個(gè)株系和GeMV的1個(gè)分離物［2］。與Comoviridae科內(nèi)豇豆花葉病毒屬（Comovirus）和蠕傳病毒屬（Nepovirus）相比，F(xiàn)abaviruses分子生物學(xué)的研究起步很晚，直到1998年末，日本學(xué)者才報(bào)道了BBWV2日本分離物的基因組全序列［4］。國(guó)內(nèi)戚益軍等［5］于2000年首次獲得BBWV2中國(guó)分離物的基因組全序列，目前已有越來(lái)越多的BBWV1和BBWV2被克隆和測(cè)序。BBWV1和BBWV2除了基因組序列有差異，其抗原表位分屬不同的血清型［6］。從發(fā)生分布來(lái)看，BBWV1主要分布于歐洲、美洲等，對(duì)辣椒、蠶豆、菠菜等造成危害。BBWV2主要分布于東亞，侵染辣椒、蠶豆及一些中草藥［1，7］，在我國(guó)迄今尚未分離到BBWV1。

加工番茄是新疆重要的經(jīng)濟(jì)作物，但是病毒病的發(fā)生與危害一直是影響其產(chǎn)量的重要因素。隨著農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易的增強(qiáng)、耕作制度的改變和傳毒介體的多樣化，田間病毒癥狀及發(fā)生危害日趨復(fù)雜，已有多種病毒被鑒定出來(lái)，如黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）、馬鈴薯 Y 病毒（Potato virus Y，PVY）、馬鈴薯 M 病毒（Potato virus M，PVM）、中國(guó)番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl Chi－na virus，TYLCCNV），其中CMV和ToMV通常以復(fù)合侵染的方式在田間造成危害［8－11］。

本研究通過(guò)RT－PCR、克隆和測(cè)序?qū)μ镩g病株上發(fā)生的BBWV2進(jìn)行了分子鑒定，并通過(guò)ELISA對(duì)田間病株的發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查，旨在為該病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病毒來(lái)源

用于病毒種類分子鑒定的23個(gè)田間病株于2009年采自石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站晚播加工番茄；用于ELISA檢測(cè)的田間病株于2010－2011年采自石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站和石河子蔬菜所。

1.1.2供試抗血清

BBWV2的單克隆抗體由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所周雪平教授惠贈(zèng)。

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

酶標(biāo)板（costar 3590）購(gòu)自美國(guó)Corning公司，酶標(biāo)儀為日本BIO－RAD Model 550型。

1.2 方法

1.2.1總RNA提取

參照改良的LiCl方法［12］提取加工番茄病株總RNA。

1.2.2 RT－PCR擴(kuò)增、克隆和序列測(cè)定

1）以病株的總RNA作為模板，用蠶豆病毒屬（Fabavirus）的兼并引物 Fab5′R1F和Fab5′R1R［13］對(duì)病株總RNA進(jìn)行RT－PCR，選取代表病株P(guān)CR產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序。

2）根據(jù)已測(cè)序列及GenBank中登錄的BBWV2的RNA1序列保守區(qū)設(shè)計(jì)了3對(duì)引物對(duì)XJ14－1基因組RNA1進(jìn)行分段RT－PCR。

3）根據(jù)基因庫(kù)中已登陸B(tài)BWV2的RNA2核苷酸序列設(shè)計(jì)了1對(duì)引物R2F－1F和R2F－1R，對(duì)基因組RNA2部分序列進(jìn)行RT－PCR。

4）將PCR產(chǎn)物分別克隆到載體pMD18－T vector（TaKaRa，Japan）上，選擇PCR和酶切鑒定均為陽(yáng)性的克隆。

委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。所用引物序列見表1。

表1 用于擴(kuò)增BBWV2基因組RNA1和RNA2的引物Tab.1 Primers used for amplifying of RNA1and RNA2of BBWV2

1.2.3序列分析

測(cè)序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行BLAST檢索。

利用軟件DNAStar 5.02和DNAMAN Version 5.2.2進(jìn)行序列分析。

多序列比較采用DNAStar clustal W方法，系統(tǒng)進(jìn)化樹使用 MEGA5.0（Amazon Inc.Masatoshi Nei and Sudhir Kumar，USA）程序進(jìn)行構(gòu)建。

1.2.4抗原制備

將田間采集的病株葉片在研缽中磨碎，用0.1 mol／L磷酸緩沖液 （pH 7.5）按1∶10的比例稀釋，4000r／min離心5min，吸取上清液備用；同時(shí)以加工番茄健康葉片提取液作陰性對(duì)照。

1.2.5 ELISA檢測(cè)

采用間接ELISA方法，用稀釋的待測(cè)抗原包被微量反應(yīng)板16－18h，封閉后，加適量稀釋的已知單克隆抗體，反應(yīng)后再加適當(dāng)濃度的酶標(biāo)抗體，經(jīng)TMB底物反應(yīng)顯色，加2mol／L硫酸終止。然后在BIORAD Model 550型酶標(biāo)儀上，于490nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，以P／N＞2.1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)（P為待測(cè)樣品OD值，N為陰性對(duì)照OD值）。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病株BBWV2的RT－PCR檢測(cè)

用蠶豆病毒屬（Fabavirus）的兼并引物Fab5′R1F和Fab5′R1R對(duì)23個(gè)病株進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，19個(gè)病株擴(kuò)增到預(yù)期大小的約400bp的DNA片段（圖1）。

選取其中 XJ7－5、XJ7－6、XJ7－9和 XJ14－1的PCR產(chǎn)物分別回收、克隆和序列測(cè)定，得到目標(biāo)片段的核苷酸（nucleotide，nt）序列分別為391、390、392和390 nt；4個(gè)序列之間的同源性為95.1%～98.2%。

基因庫(kù)（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）檢索結(jié)果表明，4個(gè)序列均與蠶豆萎蔫病毒2（BBWV－2）基因組RNA1組分5′末端第11位核苷酸開始的390～392 nt序列同源性最高，說(shuō)明經(jīng)RT－PCR檢測(cè)，具有大小約400bp片段的田間病株均被BBWV2侵染。

圖1 感病加工番茄樣品蠶豆病毒屬病毒的RT－PCR檢測(cè)Fig.1 RT－PCR amplification of Fabavirus from processing tomato samples showing viral symptom

2.2 病毒分離物XJ14－1基因組RNA1和RNA2的測(cè)序及同源性比較

為了更多了解侵染加工番茄的BBWV2的基因組信息，根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，選取病株XJ14－1，對(duì)其病毒分離物基因組RNA1和RNA2進(jìn)行克隆與測(cè)序。首先對(duì)基因庫(kù)中已登陸B(tài)BWV2的RNA1核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)了3對(duì)引物對(duì)基因組RNA1進(jìn)行分段擴(kuò)增（表1），結(jié)果如圖2所示。

圖2顯示：利用R1F－1F和R1F－1R引物擴(kuò)增到約1.2kb的特異性片斷；用 R1F－31F和 R1F－31R引物擴(kuò)增到約1.5kb的特異性片斷；用R1F－32F和R1F－32R引物擴(kuò)增到約1.7kb的特異性片斷。

將各目標(biāo)片段克隆、測(cè)序，得到核苷酸序列分別為1185、1517、765nt（該片段部分序列未被測(cè)出），再將這3個(gè)序列與之前測(cè)得的390nt拼接，獲得基因組RNA1組分5′末端第11位核苷酸開始的的3659個(gè)核苷酸。再將該序列與基因庫(kù)中已登陸的BBWV2的RNA1進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果見表2。

由表2可知：它與韓國(guó)RP3分離物的同源性最高，達(dá)到94%，與其它BBWV2的同源性在76.6%～89.7%，與BBWV1的RNA1的同源性僅為54.1%。

根據(jù)基因庫(kù)中已登陸B(tài)BWV2的RNA2核苷酸序列設(shè)計(jì)了1對(duì)引物R2F－1F和R2F－1R對(duì)基因組RNA2部分序列進(jìn)行了RT－PCR、克隆和測(cè)序，獲得1300nts的核苷酸序列結(jié)果見圖3。將該序列與基因庫(kù)中已登陸的BBWV2的RNA2進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果見表2。

由表2可知：該序列與韓國(guó)K分離物的同源性最高，達(dá)到94%，而與韓國(guó)RP3分離物的同源性為83.4%，與其它BBWV2的同源性為76.6%～86.3%，與BBWV1的RNA2的同源性很低，僅為48%。

表2 病毒分離物XJ14－1與其它蠶豆萎蔫病毒核苷酸序列相似性比較Tab.2 Comparison of nucleotide sequence identities of RNA1and RNA2between XJ14－1and other Fabavirus

圖2 XJ14－1基因組RNA1的分段擴(kuò)增Fig.2 Amplification of the XJ14－1genome segment RNA1

2.3 田間病株BBWV2的ELISA檢測(cè)

在明確加工番茄可被BBWV2侵染的基礎(chǔ)上，利用BBWV2的單克隆抗體對(duì)田間采集的不同品種（品系）加工番茄病株進(jìn)行了ELISA檢測(cè)，結(jié)果見表3。

表3顯示，20個(gè)品種都能檢測(cè)到BBWV2，陽(yáng)性率為20%～100%。257個(gè)供試病株，有137個(gè)病株檢測(cè)到BBWV2，總陽(yáng)性率為53.3%。由此說(shuō)明，田間病株帶毒率達(dá)到53.3%，并且供試20品種（品系）都可被BBWV2侵染。

圖3 XJ14－1基因組RNA2的分段擴(kuò)增Fig.3 Amplification of the XJ14－1genome segment RNA2

表3 田間病株BBWV2的ELISA檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Detection of field samples showing viral symptom by ELISA

續(xù)表3

3 結(jié)論與討論

1）有關(guān)蠶豆萎蔫病毒在新疆的最早危害始于1994年，由周俊等研究［14］，他們從表現(xiàn)斑駁的番茄病株上分離到1種球狀病毒，通過(guò)對(duì)病毒的癥狀特征、寄主范圍、衣殼蛋白氨基酸組成等初步判斷該病毒為蠶豆萎蔫病毒（BBWV），卻不能明確病毒種類是BBWV1還是BBWV2。蠶豆病毒屬（Fabavirus）的兼并引物既能作為檢測(cè)引物從病株上檢測(cè)該屬病毒，又能通過(guò)RT－PCR擴(kuò)增的片段大小有效區(qū)分該屬3種病毒（BBWV1、BBWV2和 GeMV）［13］。

本研究利用該對(duì)引物通過(guò)RT－PCR從23個(gè)加工番茄病株上檢測(cè)出19株被病毒侵染，然后通過(guò)對(duì)其中1個(gè)病毒分離物XJ14－1的基因組RNA1和RNA2進(jìn)行測(cè)序及序列比對(duì)，結(jié)果表明XJ14－1的基因組與GenBank中登錄的BBWV2都具有高的序列同源性，而與BBWV1的同源性卻很低，因此從分子水平明確新疆加工番茄受到BBWV2的侵染。

2）利用BBWV2的單克隆抗體對(duì)田間不同品種（品系）加工番茄病株進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示：田間病株帶毒率達(dá)53.3%，且供試20品種（品系）都可被BBWV2侵染；所得數(shù)據(jù)表明，BBWV2在田間發(fā)生普遍，是危害新疆加工番茄的主要病毒之一。

由于BBWV2寄主分布很廣，我國(guó)已先后在多種豆科植物及百脈草、紫云英、辣椒等多種植物上發(fā)現(xiàn)有該病毒侵染［15］。這些寄主有的是BBWV2的越冬寄主，有的是橋梁寄主，它們?yōu)椴《局芏鴱?fù)始的循環(huán)危害提供了場(chǎng)所及棲息地。因此，對(duì)該病毒在新疆的發(fā)生情況還需進(jìn)行更廣泛的調(diào)查分析。

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