許寶平，牛黎莉，賈 清

（1.甘肅省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗東部分中心，甘肅 天水 741000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

中華苦菜(Ixeris chinensis Thumb1Nakai)為菊科(Asteraceae)苦苣屬(Sonchus)1年生或2年生草本植物，又稱苦苣菜、苣荬菜和甘馬菜等，主要分布于我國北部、東部、南部及西南部，是一種藥食同源的植物。《本草綱目》載“苦菜味苦、寒、無毒，有安心益氣、治血淋痔疹、利小便，疔腫、蛇咬等功效”?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明：苦菜具有防止貧血、消暑保健、提高免疫力、抗腫瘤、促進男子精子活力和有助于傷口愈合等功效，[1-2]也具有抗炎保肝，抗煙堿，抗氧化，抗病毒，抗白血病等作用。[3]

苦菜含有甘露醇、生物堿、甙類、苦味素及黃酮類等多種成分，具有一定的抗氧化特性。而現(xiàn)在常用的抗氧化劑如2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）、丁基羥基茴香醚（BHA）及沒食子酸丙酯（PG）等，多為化學合成物質(zhì)，其安全性已引起人們的質(zhì)疑，因此，尋求高效、廣譜、安全的天然抗氧化物已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點。[4]本文以苦菜為原料，采用羥自由基·OH體系、H2O2體系以及還原能力體系，初步研究了不同溶劑提取物的抗氧化能力，旨在為苦菜的進一步開發(fā)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為中華苦菜，5月中旬采自甘肅榆中。采回的鮮樣洗凈陰干，粉碎過篩后裝于棕色瓶內(nèi)儲藏備用。

1.2 實驗試劑

硫酸亞鐵、乙醇、丙酮、番紅、乙二胺四乙酸、過氧化氫、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、α—萘胺、磷酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、可溶性淀粉、核黃素、甲硫氨酸等試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

雙光束紫外可見光分光光度計（UV-2450型）：北京瑞利分析儀器公司；RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HH-4恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；KUBOTA-3740離心機（久保田高速冷凍落地式離心機）；SHZ-IIIB循環(huán)水真空泵：江臨海市精工真空設(shè)備廠；101-2E電熱鼓風電熱恒溫干燥箱：上海儀器儀表(集團)有限公司；AL-104電子天平：上海臺衡儀器儀表有限公司；索氏抽提器；移液槍；冰箱。

1.4 方法

1.4.1 苦菜活性成分的提取

1.4.1.1 石油醚提取

精稱樣品5.000g→置于洗凈的圓底燒瓶中→往瓶中加入150mL石油醚→放水浴中浸提（20℃，8h）→抽濾→濾液冷凍離心（1℃，4000rpm，20min）→將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（水浴溫度：20℃）→向圓底燒瓶中加入5mL石油醚→在超聲波清洗器上清洗→清洗液轉(zhuǎn)移到小離心管中置冰箱中保存?zhèn)溆茫?號樣）→得殘渣1.

1.4.1.2 乙酸乙酯提取

殘渣1→置于洗凈的圓底燒瓶中→往瓶中加入150mL乙酸乙酯→放恒溫水浴中浸提（28℃，8h）→抽濾→濾液冷凍離心（1℃，4000rpm，20min）→將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（水浴溫度：30℃）→向圓底燒瓶中加入5mL乙酸乙酯→在超聲波清洗器上清洗→清洗液轉(zhuǎn)移到小離心管中置冰箱中保存?zhèn)溆茫?號樣）→得殘渣2.

1.4.1.3 丙酮提取

殘渣2→置于洗凈的圓底燒瓶中→往瓶中加入150mL丙酮→放恒溫水浴中浸提（30℃，8h）→抽濾→濾液冷凍離心（1℃，4000rpm，20min）→將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（水浴溫度：35℃）→向圓底燒瓶中加入5mL丙酮→在超聲波清洗器上清洗→清洗液轉(zhuǎn)移到小離心管中置冰箱中保存?zhèn)溆茫?號樣）。

1.4.1.4 乙醇提取

殘渣2→置于洗凈的圓底燒瓶中→往瓶中加入150mL乙醇→放入恒溫水浴中浸提（35℃，8h）→抽濾→濾液冷凍離心（1℃，4000rpm，20min）→將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（水浴溫度：40℃）→向圓底燒瓶中加入5mL乙醇→在超聲波清洗器上清洗→清洗液轉(zhuǎn)移到小離心管中置冰箱中保存?zhèn)溆茫?號樣）。

1.4.1.5 水提取

殘渣→置于洗凈的圓底燒瓶中→往瓶中加入150mL蒸餾水，浸泡→放入恒溫水浴中浸提（40℃，8h）→抽濾→濾液冷凍離心（1℃，4000rpm，20min）→將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（水浴溫度：60℃）→向圓底燒瓶中加入5mL無菌水→在超聲波清洗器上清洗→清洗液轉(zhuǎn)移到小離心管中置冰箱中保存?zhèn)溆茫?號樣）。

1.4.2 清除羥基自由基能力的測定

參照劉錫建方法[5]并修改。利用Fenton反應法，即Fe2+催化H202產(chǎn)生羥自由基：

·OH可特異地使番紅褪色，根據(jù)褪色程度用比色法來衡量·OH的含量。番紅在波長520nm處有最大吸收，在體系中加入具有清除·OH作用的提取液，若能及時清除·OH，則番紅的褪色程度降低，從而導致吸光度值減小的程度降低。測定含有提取物的反應液的吸光值，與空白液比較，從而得出提取物對·OH的清除率。

具體操作：分別于25mL容量瓶中加入0.2mol/L pH值為7.4的磷酸緩沖液1.0mL，520μg/mL番紅溶液0.2mL，EDTANa2-Fe2+1.0mL，再加入不同體積的提取液，最后加入6%H2O21mL，加蒸餾水至刻度線啟動反應；37℃恒溫水浴反應1h后，在波長520nm處測吸光度A值?？瞻捉M以等體積的蒸餾水代替提取液；對照組以等體積的蒸餾水代替提取液和EDTANa2-Fe2+溶液。根據(jù)以下公式計算·OH的清除率。

1.4.3 清除過氧化氫能力的測定

參考寧正詳?shù)确椒?，[6]在模擬胃液條件下測定樣品的過氧化氫清除率。取0.1 moL/L檸檬酸緩沖液5mL，不同體積的樣品溶液，H2O定容至25mL，加入0.lmol/L過氧化氫(用時配制)1mL，置37℃恒溫水浴中反應20 min，取出，加入l0%KI溶液2 mL，2mol/L H3P04溶液1 mL，暗處反應120min，用0.02 mol/L Na2S203溶液滴定。

1.4.4 還原能力測定

采用普魯士蘭法測定苦菜提取液的還原能力。[7]取不同體積提取液并稀釋至1.0mL，再加入0.2mol/L，pH6.6的磷酸鈉緩沖液1.0mL及1%的鐵氰化鉀1.0mL，于50℃水浴反應20min后急速冷卻,加入10%的三氯乙酸溶液1.0mL，3000rpm離心10min，取上清液2.5mL，加入蒸餾水2.0mL及0.1%三氯化鐵溶液0.5mL，混合均勻，10min后于700nm測定其吸光值，吸光值越大表示還原能力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦菜提取液對羥自由基的清除效果

由圖1可以看出，四種溶劑的苦菜提取液對Fe2+-H2O2體系產(chǎn)生的羥自由基均具有一定的清除作用，并且隨提取液濃度的增加其清除率呈增加趨勢（p＜0.05）。其中水提取液的清除率最高，當濃度為0.025g/mL時，對羥自由基的清除率能達到96%.石油醚、丙酮和乙醇提取液的清除率在濃度小于0.015g/mL時，清除率的差異較為明顯，當濃度大于0.015g/mL時，清除率差異逐漸變小。

圖1 苦菜提取液清除羥自由基的能力

2.2 苦菜提取液對過氧化氫的清除效果

由圖2可知，三種提取液對H2O2自由基都有一定的清除作用，且隨著提取液濃度的增大，對H2O2自由基的清除率也增大。水提取液和乙醇提取液對H2O2都具有較強的清除能力。當提取液濃度小于0.04g/mL時，隨著提取液濃度的增大，清除H2O2自由基的能力顯著增強（p＜0.05）；而當提取液濃度大于0.04g/mL時，隨著提取液濃度的增大，清除H2O2自由基的能力變化不明顯（p＜0.05）；丙酮提取液對H2O2自由基清除能力隨提取液濃度的增加而逐漸增強，但其清除能力明顯低于與水提取液和乙醇提取液。

圖2 苦菜提取液對過氧化氫清除率的影響

2.3 苦菜提取液還原能力的測定

由圖3可知，石油醚、丙酮、乙醇和水的苦菜提取液均具有一定的還原能力，并且隨著提取液濃度的增加，其還原能力在顯著提高（p＜0.05）。四種提取物的還原能力為：水提取液＞乙醇提取液＞丙酮提取液＞石油醚。由圖3還可以看出：當提取物濃度＞0.015g/mL時，乙醇的還原能力迅速提高，當濃度為0.025g/mL時，其還原能力達到最大。

3 結(jié) 論

圖3 苦菜提取液還原能力

中華苦菜不同溶劑逐級提取物對·OH自由基及H2O2自由基都具有較強清除作用，并且隨提取物濃度的增加而增大；苦菜水提取液對四種自由基的清除作用均強于乙醇提取液、石油醚提取液和丙酮提取液。不同溶劑逐級提取還原能力的大小順序為：水提取液＞乙醇提取液＞丙酮提取液＞石油醚提取液。對過氧化氫的清除能力：水提取液＞乙醇提取液＞丙酮提取液；對羥自由基的清除能力：水提取液＞丙酮提取液＞乙醇提取液＞石油醚提取液。

[1]周宏雷,袁久榮.中華苦荬菜化學成分的研究[J].中草藥,1996,27(5):267-268.

[2]許梅,王西奎,劉長欣,等.苦荬菜生物活性成分的提取與鑒定研究[J].山東建材學院學報,1998,12(4):304-308.

[3]李春霞,劉紅兵,管華詩.苦荬菜屬植物化學研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1999,12(5):95-99.

[4]胡迎芬.火炬果穗提取物的抗氧化作用研究[J].食品科技,2003,(9):66-68.

[5]劉錫建.沙棘果渣黃酮的提取、精制和抗氧化性能的研究[D].北京化工大學碩士學位論文,2004.

[6]寧正詳,張水華,高建華,等.一些果蔬對活性自由基和亞硝酸鹽的消除作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1995,(2):31-35.

[7]焦仲高,劉杰超,王思新.黑莓紅色素抗氧化活性研究[J].食品科技,2003,(8):63-65.