張 帆，伍 春，明海霞，侯 茜，胡 鋒，段永強，王 嵐

(甘肅中醫(yī)學(xué)院系統(tǒng)生物學(xué)與中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究所，中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)學(xué)科重點實驗室，甘肅蘭州 730000)

參苓白術(shù)散具有益氣健脾，滲濕止瀉的作用，是治療脾虛濕盛泄瀉的常用方。但其具體機制尚不清楚。血清中含有由各種不同細胞、組織和器官分泌的多種蛋白質(zhì)，機體在任一時間階段的病理、生理改變都可在血清中反映出來［1-2］。本研究從血清蛋白質(zhì)組學(xué)的角度，將蛋白質(zhì)組學(xué)和中醫(yī)證型及藥物干預(yù)研究結(jié)合起來［3-4］，用雙向凝膠電泳技術(shù)［5］分析參苓白術(shù)散對利血平所致脾虛證模型小鼠血清的二維凝膠圖譜，對治療前后表達差異明顯的蛋白點進行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定分析［6］。研究參苓白術(shù)散對該模型小鼠血清蛋白質(zhì)組的影響，探討其治療脾虛泄瀉的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物 昆明種SPF級健康小鼠，7～8周齡，雌、雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(甘)2011-0001。

1.2 主要試劑與儀器 Aurum Serum Protein Mini Kit、ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit、固 相pH梯度干膠條(IPG dry strip pH3～10 NL，17 cm)、40%(W/V)Bio-Lyte Ampholyte(pH3～10)，美國BIO-RAD公司;碘乙酰銨(IAA)、瓊脂糖、胰蛋白酶、乙晴(ACN)三氟乙酸(TFA)、基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、蛋白質(zhì) Mark、溴酚藍，美國Sigma公司;尿素、二硫蘇糖醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(Arc)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)、3-［(3-膽酰胺丙基)-二乙銨］-丙磺酸(CHAPS)、硫脲(Thiourea)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、鐵氰化鉀［K3Fe(CN)6］，美國Amresco公司;考馬斯亮藍試劑盒，南京建成;硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、甲醛、硝酸銀、乙醇、冰醋酸、醋酸鈉均為國產(chǎn)分析純。所有緩沖液均用Milli-Q水配制。

IPG-phor等電聚焦儀、Ettan DALTⅡ垂直平板電泳系統(tǒng)、Quantity One圖像分析軟件，PDQues±8.0凝膠圖像分析軟件、垂直電泳槽、電泳儀、酶標儀(Bio-Ra公司)、高速低溫離心機(Beckman公司)、SANYO-MDF-U73V超低溫冰箱(三洋電機株氏會社)、漩渦混合器、掃描儀(清華紫光)、TS—1型脫色搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3 藥物 參苓白術(shù)散:山西華康藥業(yè)股份有限公司(生產(chǎn)批號110501);利血平:廣東邦民制藥廠有限公司(生產(chǎn)批號110719)。

2 方法

2.1 動物分組 造模前隨機設(shè)正常對照組30只和造模組90只。造模成功后將造模組小鼠再隨機分為模型組、參苓白術(shù)散高劑量組、參苓白術(shù)散低劑量組。

2.2 造模及給藥 將小鼠置SPF環(huán)境中雌雄分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始造模。方法如下:正常組小鼠注射等量生理鹽水。模型組注射利血平注射液，每只小鼠按10－4g/kg于小鼠背部皮下注射，每天1次，連續(xù)17 d。第11～17日藥物干預(yù)組同時灌服參苓白術(shù)散，每天1次，低劑量組為臨床等效劑量的5倍，1.5 g/kg;高劑量組為臨床等效劑量的10倍，3 g/kg。正常飲食飲水，實驗時間共17 d［7］。

2.3 標本的采集 最后一次給藥24 h后取各組小鼠摘眼球取血，4℃靜置2 h后以5000 r/min離心5 min取上清液，置于EP管中，把同組的小鼠血清各50μL混合，置于－80℃?zhèn)溆?。同時，用比色法測定各組血清D-木糖水平(按試劑盒說明進行測定。試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號:20110504)，碘-淀粉酶比色法測定［7］小鼠血清淀粉酶。

2.4 血清中高豐度蛋白的去除 按照Aurum Serum Protein Mini Kit的操作說明，用180μL Aurum血清蛋白結(jié)合緩沖液稀釋，稀釋60μL待純化血清，取200μL稀釋的血清樣本上柱，離心，用200μL結(jié)合緩沖液清洗樹脂，再離心，收集已去除白蛋白和IgG的過濾液，以100μL分裝，－80℃保存?zhèn)溆谩２捎肂radford法測定各血清樣本的蛋白濃度后進行雙向凝膠電泳。

2.5 雙向電泳(2-DE)、銀染和圖像分析

2.5.1 第一向等電聚焦 采用17 cm長，pH3～10的固相pH梯度干膠條聚焦，總上樣量400μL含蛋白質(zhì)180μg，用Bio-Rad公司的IPG-phor等電聚焦儀進行等電聚焦。設(shè)置等電聚焦程序參數(shù)為:主動水化20℃，50 V 12 h，除鹽 250 V 30 min，1000 V 1 h，線性升壓10000 V 5 h，10000 V聚焦60000 V 5 h，500 V保持任意時間。

2.5.2 第二向SDS-PAGE電泳 平衡后的IPG膠條移至12%SDS-PAGE膠上端，加入SDS電泳緩沖液，電泳條件為:起始用低電流(5 mA/gel)待樣品完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流(25 mA/gel)，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時停止電泳。將凝膠小心地從玻璃板上剝離，輕輕置于適當大小的塑料染色盤中用雙蒸水洗3次，固定液固定過夜。

2.5.3 染色 按銀染試劑盒說明進行，包括固定、敏化、水洗、銀染、水洗、終止、水洗步驟。

2.5.4 凝膠電泳圖譜分析 硝酸銀染色后的雙向電泳凝膠采用Image Scanner TM掃描儀進行透射掃描，數(shù)字化圖像文件采用PDQuest 8.0雙向凝膠圖譜分析軟件(美國BIO-RAD公司)進行凝膠的數(shù)據(jù)分析。每組實驗重復(fù)3次，共獲得6張2-DE凝膠圖像。分別將模型組、參苓白術(shù)散低劑量組和參苓白術(shù)散高劑量組的血清蛋白圖譜與正常對照組血清蛋白圖譜進行比較，每兩組圖譜中蛋白質(zhì)的表達量相差兩倍及以上的點視為有差異的點。并選取差異較為明顯的蛋白點，進行進一步的MALDI-TOFMS鑒定分析。

2.5.5 質(zhì)譜鑒定 切取差異表達蛋白質(zhì)點，經(jīng)水洗、脫色、酶解和萃取，獲得蛋白質(zhì)的肽混合樣品，凍干備用。

取1μL樣品進行質(zhì)譜點靶鑒定，以API4800串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOF)，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式進行數(shù)據(jù)采集;PMF的質(zhì)譜掃描范圍為800～3500 Da;選擇強度最大的10個峰進行二級質(zhì)譜。將一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)整合并使用GPS3.6(Applied Biosystems)和Mascot2.1(Matrix Science)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析和蛋白鑒定。

2.5.6 差異蛋白的數(shù)據(jù)庫查詢 采用Flex analysis軟件處理肽質(zhì)量指紋譜(Peptide Mass Fingerprint，PMF)，得PMF圖譜。將肽質(zhì)量指紋譜用Matrixscience提供的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，查詢PMF所對應(yīng)蛋白質(zhì)及相關(guān)信息。

3 結(jié)果

3.1 利血平法構(gòu)建小鼠脾虛模型 本實驗用利血平造模后，空白對照組小鼠，雙眼明亮有神，活動靈活，皮毛順滑有光澤，飲食、飲水適中，大便正常。模型組小鼠，皮毛失去光澤、拱背、扎堆、活動減少、隨后出現(xiàn)皮毛枯槁、倦臥、嗜睡、便塘、肛周污穢、食量減少(P＜0.01)、消瘦等癥狀，血清D-木糖及血清淀粉酶均明顯降低(P＜0.01)。(見表1)，說明模型的復(fù)制成功［8-9］。

經(jīng)參苓白術(shù)散干預(yù)后第4天起，一般情況逐漸好轉(zhuǎn)，進食量增多、活動增加，血清淀粉酶和D-木糖水平增加(P＜0.05)。

表1 各組體質(zhì)量、食量、血清淀粉酶、血清D-木糖水平的變化()Tab.1 Diversification of body weight，food intake and serum amylase as well as serum D-xylose content in different groups()

表1 各組體質(zhì)量、食量、血清淀粉酶、血清D-木糖水平的變化()Tab.1 Diversification of body weight，food intake and serum amylase as well as serum D-xylose content in different groups()

注:與模型組比較，▲P＜0.01，*P＜0.05

組 別 劑量/(g·kg－1)動物數(shù)/只體質(zhì)量/g食量/g血清淀粉酶/(U·100 mL－1)D-木糖/(Inmol·L －1)正常對照組 － 30 24.16±2.88▲ 3.54±0.48▲ 729.23±18.69▲ 5.13±0.26▲模型組 － 30 21.30±2.71 2.86±0.56 608.82±15.60 2.73±0.41參苓白術(shù)散低劑量組 1.5 30 22.63±2.09 3.27±0.53 654.57±20.48 3.89±0.52參苓白術(shù)散高劑量組 3 30 22.56±1.91 3.45±0.52 693.64±19.50 4.73±0.35

3.2 參苓白術(shù)散對利血平致脾虛小鼠血清蛋白質(zhì)組變化的影響

3.2.1 2-DE結(jié)果 用PDQuest 8.0雙向凝膠圖譜分析軟件對正常對照組、模型組、參苓白術(shù)散高劑量組和參苓白術(shù)散低劑量組的血清電泳圖譜進行對比分析(見圖1，圖2)，在模型組中發(fā)現(xiàn)35個蛋白點與正常對照組有明顯差異，在經(jīng)過治療后，這些表達異常的蛋白點均回復(fù)至正常水平或趨于正常水平。模型組和正常組比較有25個低表達，高表達的有10個。

圖1 血清2-DE凝膠圖譜(銀染)Fig.1 Gel map of serum 2-DE(silver staining images)

圖2 差異點在二維凝膠圖譜中的局部2D及3D圖Fig.2 Local 2D and 3D map of point-of-difference in the two-dimensional gel patterns

3.2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果 對10個差異明顯的在治療組高表達的蛋白點進行質(zhì)譜鑒定，得到各個點的肽質(zhì)量指紋譜，如圖3所示。用Matrixscience提供的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，查詢PMF所對應(yīng)蛋白質(zhì)及相關(guān)信息，成功鑒定出6種蛋白質(zhì)(見表2)，分別為β-球蛋白(beta-globin)、維生素D結(jié)合蛋白(vitaminD-binding protein)、妊娠區(qū)帶蛋白(Pregnancy zone protein)、載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I)、載脂蛋白A-IV(apolipoprotein AIV)和白蛋白(albumin)。

圖3 蛋白質(zhì)點的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜結(jié)果示例Fig.3 Examples of single-point protein's MALDI-TOF-MS mass spectrometry

表2 差異表達蛋白的質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)查詢結(jié)果Tab.2 Results of mass spectrometry and data query of differential expression of proteins

4 討論

脾虛動物模型的制作方法主要包括模擬中醫(yī)傳統(tǒng)病因和用西醫(yī)病因病理造模等兩大類［10］，利血平所致動物脾虛模型，是利用西藥的副作用產(chǎn)生類似脾虛的臨床表現(xiàn)，也是脾虛實驗研究的常用模型［7］，利血平屬于腎上腺能神經(jīng)阻斷劑，用藥后交感神經(jīng)系統(tǒng)的功能受到遏制，副交感神經(jīng)系統(tǒng)的功能相對占優(yōu)勢，于是出現(xiàn)如腸運動功能亢進，大便次數(shù)增多、腹痛、腹瀉、胃酸分泌增加、潰瘍病等副作用［11］。建立脾虛證動物模型應(yīng)考慮與脾運化功能失職相關(guān)的指標。利血平所致的脾虛小鼠模型在一定程度上反映了類似的病理改變，其表現(xiàn)和中醫(yī)脾虛證有高度的相符性。

參苓白術(shù)散是由人參、茯苓、白術(shù)、甘草、山藥、扁豆、薏苡仁、桔梗、砂仁、蓮子等組成，功效健脾益氣，滲濕止瀉;主治脾胃虛弱，食少便塘，四肢乏力，形體消瘦等證。據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究，該藥大劑量時能抑制腸管的收縮，小劑量時則可興奮之。張仲林等［12］通過研究發(fā)現(xiàn)，正常小鼠灌服參苓白術(shù)散后胃的排空速度明顯加快，對胃輕癱小鼠的胃排空能力顯著提高，并能使腹瀉小鼠的腹瀉次數(shù)及腹瀉量減少，這一結(jié)果表明參苓白術(shù)散對動物的胃腸具有雙向調(diào)節(jié)功能。針對利血平致脾虛模型小鼠的特點及參苓白術(shù)散的藥理作用，本研究選用參苓白術(shù)散對利血平致脾虛小鼠進行藥物干預(yù)，在用藥7 d后，檢測其血清蛋白質(zhì)組的變化，經(jīng)質(zhì)譜分析，從10個高表達的蛋白中鑒定出β-球蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、妊娠區(qū)帶蛋白、載脂蛋白 A-I、載脂蛋白 A-IV和白蛋白等6種蛋白，這6種蛋白在脾虛證模型小鼠血清中表達下調(diào)，在參苓白術(shù)散高劑量組表達上調(diào)，且高劑量組的蛋白表達量基本和正常對照組一致。模型組小鼠在用參苓白術(shù)散灌胃7 d后，脾虛癥狀得到改善。

維生素D結(jié)合蛋白主要由肝實質(zhì)細胞合成［13］，是一種多功能的血漿蛋白質(zhì)。其中一項重要功能是作為維生素D的載體蛋白。還可以清除血漿的代謝物、內(nèi)毒素和壞死細胞釋放到細胞外的一些有害物質(zhì)［14］。在免疫方面也有重要功能，可以和B淋巴細胞表面的IgG、T淋巴細胞表面的Fc受體及單核細胞結(jié)合，在急性組織損傷反應(yīng)中可轉(zhuǎn)化為巨噬細胞的激活因子、增強中性粒細胞趨化作用等［15］。

載脂蛋白A-I(ApoA-I)是體內(nèi)含量最多的載脂蛋白之一，其合成部位主要是肝臟、小腸，它與高密度脂蛋白結(jié)合，在機體非特異性免疫過程中發(fā)揮抗內(nèi)毒素的功能［16］。脾虛時由于ApoA-I表達降低，使機體非特異性免疫功能紊亂。

載脂蛋白A-IV(ApoA-IV)是由腸道細胞分泌的一種蛋白質(zhì)，隨乳糜微粒經(jīng)淋巴系統(tǒng)進入血液?？筛鶕?jù)生理條件的不同而在各種脂蛋白之間重新分布，參與脂蛋白的代謝，主要參與外源性脂肪的吸收及高密度脂蛋白的成熟過程，與ApoA-I共同參與機體的非特異性免疫。在人體，除了小腸，下丘腦也可分泌 ApoA-IV［17］。腸道 ApoA-IV的合成和分泌主要受脂肪吸收的刺激［18］。

本研究中脾虛的表現(xiàn)主要體現(xiàn)在小腸功能紊亂，小腸吸收功能障礙，由于脾虛證小鼠腸道吸收不良，使機體細胞內(nèi)氨基酸、糖類、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)水平下降，細胞中合成蛋白質(zhì)原料及能量不足，導(dǎo)致細胞合成蛋白質(zhì)的能力降低，從而使多種蛋白的合成不足，機體免疫功能低下，腸道細胞損傷。參苓白術(shù)散干預(yù)利血平所致脾虛小鼠后，以上6種蛋白質(zhì)表達上調(diào)。提示參苓白術(shù)散能直接調(diào)節(jié)脾虛小鼠的免疫功能、促進與小腸吸收功能相關(guān)的蛋白質(zhì)正常表達，保護其腸組織和腸細胞的損傷［19］，本研究為探討脾虛證的本質(zhì)、診斷的客觀化奠定了基礎(chǔ)。

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