蔚曉敏，程菲兒，張苗青，馮翠萍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷030801）

藏靈菇是乳白色膠狀的顆粒物，源于俄羅斯畢加索高原的一種天然的酸奶發(fā)酵劑，屬于開菲爾的一個品系［1］，有“西藏雪蓮”之稱［2］。藏靈菇酸奶有提高免疫力、改善動脈粥樣硬化、降低膽固醇、調(diào)節(jié)腸道菌群和抗疲勞等功效［3～6］。藏靈菇外表上棲息著多種有益微生物，主要是乳酸細(xì)菌和酵母菌。由于藏靈菇復(fù)雜的菌相在分批發(fā)酵過程中穩(wěn)定性差，直接使用易發(fā)生菌相失衡，影響藏靈菇酸奶的品質(zhì)，不能發(fā)揮其應(yīng)有的價值。因此，對藏靈菇發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌進(jìn)行分離鑒定，可為功能性藏靈菇乳制品研發(fā)提供優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藏靈菇市售。

1.1.2 純牛奶

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)無抗生素牛奶。

1.1.3 培養(yǎng)基

M17培養(yǎng)基（酪蛋白的胰蛋白酶消化物2.5 g，肉的胃蛋白酶消化物2.5 g，大豆的木瓜酶消化物5 g，酵母提取物2.5 g，牛肉膏5 g，β－磷酸甘油二鈉10 g，Mg SO40.25 g，抗環(huán)血酸0.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水950 mL，乳糖溶液50 mL，p H 7.1～7.2）、MRS培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、產(chǎn)硫化氫培養(yǎng)基、石蕊牛乳培養(yǎng)基、吲哚培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基等。

1.1.4 儀器設(shè)備

超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電子天平：奧豪斯儀器有限公司；CX21FS1型生物顯微鏡；恒溫培養(yǎng)箱：北京東聯(lián)哈兒儀器制造有限公司；低速離心機(jī)：北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司；NDJ－1型旋轉(zhuǎn)式粘度計：上海舜宇平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藏靈菇發(fā)酵乳的制備

藏靈菇用滅菌水沖洗后，接種2%到85℃、30 min滅菌后冷卻的牛乳中，25℃培養(yǎng)24 h。重復(fù)活化3次，作為發(fā)酵劑備用。

1.2.2 乳酸球菌的分離純化

挑取藏靈菇發(fā)酵乳在M17培養(yǎng)基上平板劃線，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再平板劃線分離純化直至鏡檢為純培養(yǎng)物。各菌株分別進(jìn)行涂片革蘭氏染色和接觸酶實驗，將革蘭氏染色陽性且接觸酶陰性的菌株接種于該斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后于4℃冰箱中保藏備用。

1.2.3 乳酸桿菌的分離純化

用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行分離，42℃恒溫培養(yǎng)，分離純化方法同1.2.2。

1.2.4 乳酸細(xì)菌菌屬的生理生化鑒定

經(jīng)革蘭氏染色陽性，接觸酶陰性，初步確定為乳酸菌。根據(jù)顯微鏡細(xì)胞形態(tài)觀察，將細(xì)胞排列呈單個或成對的短或長的桿菌進(jìn)行明膠液化實驗，吲哚實驗，硫化氫實驗，硝酸鹽還原實驗和運動實驗。將單個、成對或鏈狀排列的球菌進(jìn)行硝酸鹽還原實驗和運動實驗，兩個都為陰性的進(jìn)行葡萄糖產(chǎn)氣實驗，6.5%Na Cl和4%Na Cl的需鹽實驗，10℃和45℃生長實驗［7～9］。

1.2.5 乳酸球菌菌屬的鑒定

硝酸鹽還原陰性，運動實驗陰性，葡萄糖不產(chǎn)氣，在10℃和45℃及6.5%Na Cl均不能生長的進(jìn)行乳糖和麥芽糖的發(fā)酵實驗，以確定乳酸球菌的菌屬［8～10］。

1.2.6 乳酸桿菌和乳酸鏈球菌菌屬的鑒定

將明膠液化實驗，吲哚實驗，硫化氫實驗，硝酸鹽還原實驗均為陰性且不運動的實驗菌株各自進(jìn)行D－果糖，菊糖，葡萄糖，山梨醇，乳糖，蔗糖和麥芽糖的發(fā)酵實驗，確定乳酸桿菌和乳酸鏈球菌的菌屬［8，9］。

1.3 發(fā)酵酸奶菌株的篩選

對分離出的球菌和桿菌通過酸度，粘度和感官評分篩選，用于酸奶的制備。感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards of sensory evaluation

1.4 藏靈菇酸奶復(fù)合發(fā)酵劑的制備

1.4.1 發(fā)酵劑的制備

10 mL新鮮牛乳（試管）→滅菌（121℃，15 min）→冷卻（35～40℃）→接種（分離出的菌株）→恒溫培養(yǎng)至凝乳→發(fā)酵劑

1.4.2 酸奶制備工藝

新鮮牛乳→滅菌（85℃，30 min）→冷卻（35～40℃）→接種→培養(yǎng)→后熟（4℃冰箱）

1.5 制備酸奶最優(yōu)條件篩選

以球桿菌比例，發(fā)酵溫度，接種量為因素，采用三因素三水平L9（33）正交試驗，以其酸度，乙醛，粘度為指標(biāo)，確定其最佳條件。因素水平見表2。

表2 正交因素水平表Table 2 The factors and levels oforthogonal optimization

1.6 指標(biāo)的測定方法

1.6.1 酸度的測定

取10 mL待測乳樣用0.1 mol·L－1的氫氧化鈉滴定，以吉兒涅爾度（°T）為單位。

1.6.2 粘度的測定

根據(jù)粘度計的指針旋轉(zhuǎn)速度來測酸奶的粘稠度。

1.6.3 乙醛的測定

將待測乳樣與16%的TCA（三氯乙酸）等體積混勻，3000 r·min－1離心20 min，取澄清的上清液25 mL與5 mL 1%Na HSO4溶液加入錐形瓶搖勻，室溫放置1 h后，加入1 mL 1%淀粉指示劑，用0.1 mol·L－1碘液滴定至終點（淡藍(lán)紫色，30 s不褪色），再加20 mL 1 mol·L－1Na HCO4，震蕩30 s（藍(lán)紫色褪去），用碘液繼續(xù)滴定至終點，記錄消耗碘液體積。并做空白的滴定。測定3次，取平均值，計算乙醛含量［11］。

V1－樣品消耗碘液的體積／mL；V2－空白消耗碘液的體積／mL；C－碘液濃度／mol·L－1；0.022－乙醛化學(xué)反應(yīng)基本單位／g；25－乙醛樣品的體積／mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的鑒定

2.1.1 乳酸菌菌屬的鑒定

本研究分離到7株菌株，編號為L1～L7，結(jié)果見表3。由表3可見，硝酸鹽還原實驗皆為陰性，葡萄糖產(chǎn)酸實驗皆為陰性且不運動，石蕊牛乳實驗中均變紅，6.5%的Na Cl實驗中都不能生長，4%的Na Cl實驗中只有L2、L3、L5、L6和L7可以正常生長，據(jù)東秀珠等的常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［7］初步確定L1、L4為乳酸鏈球菌屬，L2、L3為乳酸球菌屬，L5、L6和L7為乳酸桿菌屬。

表3 乳酸菌的菌屬鑒定結(jié)果Table 3 The results of identification of Lactic acid bacteria

2.1.2 乳酸球菌種間的鑒定

將初步鑒定為乳酸乳球菌屬的菌株L2和L3進(jìn)行乳糖和麥芽糖的發(fā)酵產(chǎn)酸實驗，均是陽性，根據(jù)乳酸細(xì)菌分離鑒定及實驗方法［9］，確定兩個菌株均為乳酸乳球菌乳酸亞種。

2.1.3 乳酸桿菌種的鑒定

對初步鑒定為是乳酸乳桿菌的3株菌株進(jìn)行糖醇產(chǎn)酸實驗，L5和L7菌株對實驗糖醇產(chǎn)酸均為陽性，L6菌株對菊糖，葡萄糖，乳糖的發(fā)酵產(chǎn)酸為陽性，對蔗糖，D－果糖，山梨醇和的發(fā)酵產(chǎn)酸為陰性，根據(jù)常見細(xì)菌鑒定手冊［7］和伯杰細(xì)菌鑒定手冊［10］確定L5和L7為彎曲乳桿菌，L6為類高菲爾乳桿菌。

2.1.4 乳酸鏈球菌種的鑒定

將乳酸鏈球菌屬的2株菌株進(jìn)行糖醇類產(chǎn)酸實驗，L1和L4菌株對蔗糖，菊糖，D－果糖，葡萄糖，山梨醇，乳糖，麥芽糖實驗均為陽性。據(jù)文獻(xiàn)初步確定均為唾液鏈球菌［7～10］。

2.2 菌種篩選試驗

由于L1和L4菌株同為唾液鏈球菌，L2和L3同為乳酸乳球菌乳酸亞種，L5和L7同為彎曲乳桿菌，因此選用L1、L2、L5、L6作為篩選菌株。

由表4可見，L1菌株產(chǎn)酸一般，產(chǎn)粘最高，感官評分較高；L2菌株的產(chǎn)酸一般，產(chǎn)粘偏高，感官評分最高。L5菌株產(chǎn)酸最高，產(chǎn)粘一般，感官評分較高；L6菌株產(chǎn)酸較高，產(chǎn)粘較少，感官評分最低。綜合分析后用L1、L2和L5做復(fù)合發(fā)酵劑，且球菌中L1與L2的比值為1∶1。

表4 菌株的篩選結(jié)果Table 4 Result of strain screening

2.3 最佳發(fā)酵條件的確定

乙醛是酸奶重要的風(fēng)味物質(zhì)，使酸奶具有堅果仁風(fēng)味，粘度能提高酸奶的穩(wěn)定性，是組織性狀的重要指標(biāo)，酸度是酸奶的常規(guī)指標(biāo)，因此把乙醛產(chǎn)量，粘度和酸度作為酸奶的檢測指標(biāo)，以此確定最適的發(fā)酵條件。

由表5和表6可見，溫度對發(fā)酵劑酸度的影響較大，差異顯著，綜合黏度和乙醛產(chǎn)量的指標(biāo)可知B2為最佳水平，最佳發(fā)酵溫度為40℃。

表5 正交實驗方案及結(jié)果Table 5 Orthogonal experi ment methods and results

表6 乙醛的方差分析表Table 6 Analysis of variance table of acetaldehyde

由表5和表7可見，接種量對酸奶中乙醛產(chǎn)量的影響較大，差異非常顯著，結(jié)合接種量對黏度和酸度的影響，C1為最佳水平，最佳接種量為2.5%。

由表5和表8可見，球菌桿菌的比例對藏靈菇的粘度影響較大，差異顯著。由球桿菌比例對乙醛產(chǎn)量和酸度影響的分析，A1為最佳水平，球桿菌比例為2∶1時最佳。

表7 酸度的方差分析表Table 7 Acidity of the anovatable

表8 粘度的方差分析Table 8 Variance analysis of viscosity

3 結(jié)論與討論

藏靈菇發(fā)酵乳中存在著多種微生物細(xì)胞形態(tài)，但本實驗僅分離得到7株乳酸細(xì)菌，原因可能是所選用的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件只適合這部分菌株的正常生長，或有些乳酸細(xì)菌不能在組合培養(yǎng)基上良好生長，這樣使得其它部分微生物的分離及進(jìn)一步的利用受到一定程度的限制。藏靈菇復(fù)雜的菌系有待進(jìn)一步研究。

在劃線分離得到菌株的過程中多次出現(xiàn)乳酸球菌整齊排列在酵母菌周圍的現(xiàn)象，據(jù)周劍忠［1］介紹酵母菌同乳酸細(xì)菌為共生關(guān)系，但相關(guān)研究報道資料很少。乳酸細(xì)菌與酵母菌是否有共生關(guān)系需要進(jìn)一步的研究。

本試驗共分離到7株乳酸菌，分別為2株乳酸球菌乳酸亞種，2株唾液鏈球菌、2株彎曲乳桿菌和1株類高加索乳桿菌。

當(dāng)球桿菌比例2∶1，溫度40℃，接種量2.5%時發(fā)酵酸奶的效果最好。

［1］周劍忠.藏靈菇微生物分析生態(tài)分析及微膠囊化發(fā)酵劑的研究［D］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005：1－2，48.

［2］周劍忠，董明盛，江漢湖.PCR－DGGE指紋技術(shù)與分離技術(shù)結(jié)合篩選藏靈菇發(fā)酵過程的優(yōu)勢菌［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（8）：1632－1638.

［3］劉慧，王世平，冉冉，等.藏靈菇源酸奶復(fù)合菌發(fā)酵劑對大鼠脂質(zhì)過氧化的影響［J］.中國食品學(xué)報，2010，10（3）：27－32.

［4］齊紅霞.藏靈菇發(fā)酵乳的抗疲勞作用研究［D］.吉林大學(xué)，2008：36.

［5］劉慧，王世平，冉冉，等.藏靈菇源酸奶復(fù)合菌發(fā)酵劑對腸道菌群平衡的作用［J］.中國食品學(xué)報，2011，11（6）：7－12.

［6］劉慧，陳湘寧，李晨，等.藏靈菇酵母菌 M3耐胃腸道逆環(huán)境特性及降膽固醇的實驗研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（15）：60－63.

［7］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：242－267，364－370.

［8］布坎南RE，吉本斯 NE.伯杰細(xì)菌鑒定手冊（第八版）［M］.北京：科學(xué)出版社，1984：797－822.

［9］杜鵬.乳品微生物學(xué)實驗技術(shù)［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2008：87－92.

［10］凌代文，東秀株.乳酸細(xì)菌分離鑒定及實驗方法［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：45－46.

［11］李妍，邢慧敏，張和平，等.發(fā)酵乳中丁二酮和乙醛含量檢測方法探討［J］食品與發(fā)酵工業(yè)，2008（3）：157－159.