劉建壘，郝利平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷03080）

燕麥，又稱莜麥、玉麥、雀麥、鈴鐺麥，分為帶稃型燕麥（Avena sativa L.）和裸粒型燕麥（Avena nuda L.）兩大類(lèi)，在我國(guó)以裸燕麥為主?，F(xiàn)代研究表明燕麥具有降血脂、降血糖、免疫增強(qiáng)、抗氧化、益生等多種保健功能［1～3］。燕麥中蛋白質(zhì)含量最高可達(dá)20%，在禾谷類(lèi)作物中居首位［4］。燕麥蛋白功效比（PER）達(dá)2.25～2.38，氨基酸分?jǐn)?shù)（AAS）高達(dá)68.2，生物價(jià)（BV）為74.5～79.6，均是植物蛋白中的佼佼者［5～7］。燕麥蛋白質(zhì)含人體8種必需氨基酸，其配比接近FAO／WHO推薦的模式，限制性氨基酸賴氨酸和色氨酸含量相對(duì)較高［8，9］，賴氨酸含量為大米和小麥粉的2倍以上，有益于增進(jìn)智力和骨骼發(fā)育，能彌補(bǔ)我國(guó)傳統(tǒng)膳食結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致的“賴氨酸缺乏癥”缺陷［10］，色氨酸具有改善睡眠，預(yù)防糙皮病、抑郁癥和調(diào)節(jié)情緒等功能，被稱為“第二必需氨基酸”［11］。

本研究選用產(chǎn)量高、抗旱性好，適應(yīng)性強(qiáng)的燕麥新品種晉燕14號(hào)為研究對(duì)象，用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響堿提酸沉法提取燕麥蛋白的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，分析各影響因素及其交互作用對(duì)蛋白提取率的影響，以期為燕麥全粉中蛋白質(zhì)的提取和利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥：晉燕14號(hào)，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所提供（脫脂燕麥全粉中蛋白質(zhì)含量為15.6%）；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

KDN 型定氮儀（HYP8.14.20孔消化裝置、2C型蒸餾裝置），上海釬檢儀器有限公司；JY－15 A 750克多功能粉碎機(jī)，永康市江業(yè)制造有限公司；UV－2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；p HS－25型數(shù)顯p H計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；JDG－0.2真空凍干試驗(yàn)機(jī)，蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司；SHY－2 A水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

燕麥→粉碎、脫脂→脫脂燕麥全粉→堿液浸提→等電點(diǎn)沉淀→水洗至中性→真空冷凍干燥→燕麥蛋白。

1.3.2 方法

分別對(duì)p H值、料液比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)，確定燕麥蛋白的提取條件，重復(fù)3次。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)p H、料液比、提取溫度、提取時(shí)間，4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，確定堿提酸沉法制備燕麥蛋白的最佳工藝條件。

1.3.3 燕麥蛋白等電點(diǎn)的確定

在得到的最佳提取條件下提取燕麥蛋白，取8等份蛋白提取上清液，分別用1 mol·L－1HCl緩慢調(diào)其 p H 至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，靜置6 h，4000 r·min－1離心15 min，測(cè)定沉淀前后上清液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白分離率。

1.3.4 測(cè)定與計(jì)算方法

固體中蛋白質(zhì)含量測(cè)定：凱氏定氮法，參照GB5009.5－2010。

溶液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定：Bradford法［12］，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝6.4343x－0.0079，R2＝0.9978。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿提酸沉法提取燕麥蛋白單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 p H值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖1可見(jiàn)，隨p H的升高，燕麥蛋白的提取率呈上升趨勢(shì)。其中，p H在8～10內(nèi)，隨p H的升高燕麥蛋白的提取率迅速上升，在p H 10～12內(nèi)，燕麥蛋白的提取率上升緩慢。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)p H超過(guò)11時(shí)，蛋白提取液顏色加深，呈棕褐色，有異味，且溶液變得十分粘稠，不利于進(jìn)一步的分離。因此，選擇p H 10為試驗(yàn)條件下的最佳p H，此時(shí)蛋白提取率達(dá)59.35%。

圖1 p H值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of p Hon extraction rate of oat granules

2.1.2 液料比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖2可見(jiàn)，在液料比為8～16內(nèi)，隨液料比的升高，燕麥蛋白的提取率迅速上升，液料比為16時(shí)，燕麥蛋白的提取率最高，達(dá)60.36%；當(dāng)液料比超過(guò)16時(shí)，蛋白的提取率變化不大。

圖2 液料比值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of liquid－to－solid ratio on extraction rate of oat granules

2.1.3 浸提溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖3可見(jiàn)，在溫度20～40℃內(nèi)，隨溫度的升高，燕麥蛋白的提取率上升較快；在40～50℃時(shí)，燕麥蛋白的提取率上升最快；當(dāng)溫度為50℃時(shí)，燕麥蛋白的提取率達(dá)59.99%，為最大值；超過(guò)50℃后，燕麥蛋白的提取率迅速下降。

圖3 浸提溫度值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction rate of oat granules

2.1.4 浸提時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖4可見(jiàn)，在時(shí)間為30～90 min內(nèi)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，燕麥蛋白的提取率呈上升趨勢(shì)，在90 min時(shí)，燕麥蛋白的提取率最大，為63.31%；超過(guò)90 min后，燕麥蛋白的提取率變化不大。

圖4 浸提時(shí)間值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of time on extraction rate of oat granules

2.1.5 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化堿提酸沉法提取燕麥蛋白工藝

2.1.5.1 Box－Behnken試驗(yàn)因素的確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box－Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響燕麥蛋白提取率的4個(gè)因素（p H、液料比、溫度和時(shí)間）進(jìn)行全因素響應(yīng)面分析，因素水平表如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 1 Factor levels and their coding

2.1.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)及方差分析

Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。為了更準(zhǔn)確估計(jì)試驗(yàn)誤差，對(duì)中心點(diǎn)p H 10、液料比16、浸提溫度50℃、浸提時(shí)間90 min重復(fù)5次，得中心點(diǎn)條件下的平均蛋白提取率達(dá)63.20%。進(jìn)一步用 Design－Expert.V8.0.6 進(jìn) 行 響 應(yīng) 面分析，得到回歸方程：提取率 Y＝2.33 A－0.96B＋2.16C＋1.35D＋4.74 A＊B－1.68 A＊C＋0.88 A＊D－1.25B＊C－0.16B＊D＋0.68C＊D－5.02 A2－9.99B2－5.54C2－4.66D2＋63.20。

表2 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Result of Box－Behnken design

續(xù)表2

對(duì)模型進(jìn)行矢擬性檢驗(yàn)和方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，此二次多項(xiàng)式模型的一次項(xiàng)和交互項(xiàng)極顯著，平方項(xiàng)在顯著范圍內(nèi)，而立方項(xiàng)不顯著。該模型的失擬性不顯著，模型極顯著，說(shuō)明該模型是合理可行的，能對(duì)各因素變化對(duì)燕麥蛋白提取率的影響有良好的預(yù)測(cè)作用。

表3 模型的矢擬性檢驗(yàn)Table 3 Lack of fit test

進(jìn)一步對(duì)二次多項(xiàng)式模型及各系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，p H、溫度對(duì)燕麥蛋白提取率的影響極顯著，時(shí)間對(duì)燕麥蛋白提取率的影響顯著；交互作用中p H和液料比的交互作用極顯著，其他因素間的交互作用均不顯著；4個(gè)因素的二次項(xiàng)對(duì)燕麥蛋白提取率的影響極顯著。

2.1.5.3 響應(yīng)曲面分析

響應(yīng)面圖能直觀地反映各因素對(duì)蛋白提取率的影響。從圖5可見(jiàn)，燕麥蛋白提取率隨p H和液料比的變化先增大后減小，且坡度較大，等高線密集，并出現(xiàn)極大值，表明兩者的交互作用顯著；其他因素間的響應(yīng)面平緩，交互作用不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。為進(jìn)一步求得各因素的最優(yōu)條件，以提取率最大為目標(biāo)，對(duì)各因素在試驗(yàn)范圍內(nèi)進(jìn)行最優(yōu)化處理，得到最佳提取工藝為：p H 10.11、液料比15.96、溫度50.87℃、時(shí)間93.56 min，此時(shí)提取率達(dá)63.76%。驗(yàn)證試驗(yàn)得該條件下燕麥蛋白的提取率達(dá)64.23%，純度達(dá)86.4%。

表4 二次多項(xiàng)式模型的方差分析表Table 4 Analysis of variance for Response Surface Quadratic Model

圖5 p H與液料比對(duì)蛋白提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour map for extraction rate of OPI under different p Hand liquid－solid ratio

2.1.6 燕麥蛋白等電點(diǎn)的確定

由圖6可見(jiàn)，堿提酸沉法提取的燕麥蛋白的等電點(diǎn)為4.2，分離率達(dá)94.65%。p H 在4.0～4.5內(nèi)，燕麥蛋白的分離率均達(dá)93.4%以上，分離效果較好。

圖6 燕麥蛋白等電點(diǎn)的確定Fig.6 Determination on pI of oat protein

3 結(jié)論與討論

堿提酸沉法制備燕麥蛋白的最佳工藝為：p H 10.11、液料比15.96、溫度50.87℃、時(shí)間93.56 min，此時(shí)，提取率達(dá)64.23%，純度達(dá)86.4%，得到的燕麥蛋白的等電點(diǎn)為4.2，分離率達(dá)到94.65%。

堿提酸沉法制備燕麥蛋白的p H不能超過(guò)11，否則會(huì)導(dǎo)致蛋白提取液顏色加深，產(chǎn)生異味，且溶液變得十分粘稠，不利于進(jìn)一步的分離；為提高燕麥蛋白的提取率，同時(shí)減少燕麥蛋白的變性，提取溫度控制在50℃左右為宜；當(dāng)液料比超過(guò)16，或浸提時(shí)間超過(guò)90 min后，增加液料比或延長(zhǎng)浸提時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響不大。

用此方法制備的燕麥蛋白粉顏色稍有褐變，可能是由于提取過(guò)程中蛋白質(zhì)與還原糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)，或燕麥中的酚類(lèi)物質(zhì)氧化所致，其褐變機(jī)理及脫色方法還需進(jìn)一步研究。

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