汪雯翰，張勁松，楊 焱，嚴(yán)夢(mèng)秋，吳 迪，吳 娜，章 慧

國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部應(yīng)用真菌資源與利用重點(diǎn)開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403

食用菌是指一類可供人們食用的大型真菌，具有肉質(zhì)、膠質(zhì)或纖維質(zhì)的子實(shí)體，我們俗稱為“菇”、“蕈”、“菌”、“耳”，例如香菇、黑木耳、銀耳、榆耳和雙孢蘑菇等距今7000年前的河姆渡文化已有人類將食用菌作為食物的記錄，而在2000多年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》中則具有關(guān)于赤芝、紫芝、黑芝、白芝、茯苓和木耳等多種食用菌藥效學(xué)的文字記錄，其中關(guān)于靈芝的記載為“益心氣、解胸中結(jié)、補(bǔ)中、增智慧、不忘，延年神仙等”，因而食用菌除具有口味鮮美和肉質(zhì)細(xì)嫩等優(yōu)點(diǎn)以外，還具有一定的醫(yī)療保健功能。

隨著生活水平的不斷提高，保健食品開(kāi)發(fā)已逐漸成為食品開(kāi)發(fā)的潮流和發(fā)展方向，具有良好的前景和廣大的市場(chǎng)潛力，食用菌因具有食用性和保健性，是功能食品開(kāi)發(fā)的優(yōu)良原料。國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于食藥用菌抗氧化活性的文獻(xiàn)報(bào)道，然而此類文章主要集中于報(bào)道單一品種的抗氧化活性研究，缺乏對(duì)多種食用菌提取物同時(shí)在抗氧化和延緩衰老等多種模型上藥效學(xué)的比較研究［1-3］。本實(shí)驗(yàn)采用清除自由基模型、細(xì)胞抗氧化和延緩衰老模型從桑黃等十種常見(jiàn)的食藥菌醇提物中篩選出抗氧化延緩衰老活性強(qiáng)的品種，為后續(xù)的食用菌功能食品開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 食用菌原料

桑黃(銹革孔菌科、木層孔菌屬，Phellinus baumii Pliát)子實(shí)體由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所在2010年栽培獲得，菌種保存于中國(guó)微生物菌種保藏中心上海食用菌分中心，標(biāo)本存放于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所加工技術(shù)與發(fā)酵工程研究室;樺褐孔菌(銹革孔菌科、纖孔菌屬，Inonotus obliquus(Pers.:Fr.)Pilát)，于 2009 年購(gòu)自于黑龍江哈爾濱市關(guān)東天然物產(chǎn)商社;靈芝(靈芝科、靈芝屬 Ganoderma lingzhi Sheng H.Wu，Y.Cao ＆ Y.C.Dai)，子實(shí)體由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所在2009年栽培獲得，菌種保存于保存于中國(guó)微生物菌種保藏中心上海食用菌分中心，標(biāo)本存放于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所加工技術(shù)與發(fā)酵工程研究室;香菇(小皮傘科、微香菇屬 Lentinula edodes(Berk.)Pegler);杏鮑菇(側(cè)耳科、側(cè)耳屬，Pleurotus eryngii(DC.)Quél.);雞腿菇(傘菌科、鬼傘屬，Coprinus comatus(O.F.Müll.)Pers.);灰樹(shù)花(薄孔菌科、灰樹(shù)花屬 Grifola frondosa(Dicks.:Fr.)Gray);猴頭(猴頭菌科、猴頭菌屬，Hericium erinaceus(Bull.:Fr.)Pers.);姬松茸(傘菌科、蘑菇屬，Agaricus blazei Murrill);蛹蟲(chóng)草(蟲(chóng)草菌科、蟲(chóng)草菌屬，Cordyceps militaris(Fr.)Link)，以上子實(shí)體均于2011年購(gòu)自上海百信生物科技有限公司;以上10種食藥用菌均經(jīng)廣東省微生物研究所李泰輝研究員鑒定為各自的子實(shí)體。

1.1.2 試劑

Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培養(yǎng)基(#946880)、RPMI-1640(#1016442)、胎牛血清(#8172881)、馬血清(#1021372)和胰酶(含0.25%EDTA)(#1128331)購(gòu)自GIBCO公司;疊氮鈉(Sodium azide，NaN3)(#20030401)和二甲亞砜［Dimethyl sulfoxide，DMSO(#RNBB8137)］購(gòu)自 Sigma公司;鏈霉素(#3061B12)、青霉素(#0610S02)和3-(4，5-dimethylthiozol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)(#11088866001)購(gòu)自AMERSCO公司;30%H2O2(#20061130)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.3 儀器

DJ-10A中藥粉碎機(jī)(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司);BC-R2001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司);Heto PL-3000冷凍干燥機(jī)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司);Synergy HT多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO2TEK公司);Delta series生物安全柜(美國(guó)LABCONCO公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙醇提取物的制備

分別取干燥的十種食用菌子實(shí)體粉末30 g，依次加入10倍體積95%乙醇，25℃浸泡24 h，過(guò)濾，殘?jiān)貜?fù)上述操作一次，合并兩次濾液，濃縮揮去乙醇后，冷凍干燥，即得。

1.2.2 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 清除超氧陰離子試驗(yàn)

上述乙醇提取物分別用DMSO配制成不同濃度(200、500 和2000 μg/mL)的溶液，改進(jìn)郭藹光［5］的方法測(cè)定對(duì)超氧陰離子的清除率。分別取10 μL加入96孔板(空白對(duì)照為DMSO，陽(yáng)性對(duì)照為樣品相同濃度的Vc溶液)，由泵1泵入10 μL 6.25×10-4mol/L鄰苯三酚溶液，泵2泵入150 μL魯米諾-CBS溶液(pH 10.2)，在20℃啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，每0.6 s記錄一次發(fā)光值，連續(xù)記錄30 s。超氧陰離子清除率按公式(1)計(jì)算:

公式(1):

1.2.2.2 清除H2O2自由基試驗(yàn)

乙醇提取物分別用DMSO配制成不同濃度(200、500 和 2000 μg/mL)的溶液，改進(jìn) Toshimasa Toyo’oka等［6］方法測(cè)定乙醇提取物對(duì)H2O2的清除率。分別取5 μL樣品加入96孔板(空白對(duì)照為DMSO，陽(yáng)性對(duì)照為樣品相同濃度的Vc溶液)，由泵1泵入150 μL魯米諾-CBS溶液(pH 9.5)，泵2泵入10 μL 6%H2O2，在20℃啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，每0.6 s記錄一次發(fā)光值，連續(xù)記錄30 s，H2O2自由基清除率按公式(1)計(jì)算。

1.2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12(腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)于2009年在中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心購(gòu)買。PC12細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM，內(nèi)含25 mL/L胎牛血清和150 mL/L馬血清，青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 IU/mL;細(xì)胞培養(yǎng)于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞匯集至85%時(shí)進(jìn)行傳代接種，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 體外PC12細(xì)胞氧化損傷試驗(yàn)

參照胡金霞［7］實(shí)驗(yàn)方法，并略作改動(dòng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基稀釋至2×104個(gè)/mL。取190 μL細(xì)胞懸液接于96孔板中，然后分別加入10 μL 0.25 mmol H2O2刺激4 h。用DMEM培養(yǎng)基將樣品稀釋到不同濃度的樣品溶液(2、10和40 mg/mL)將全部培養(yǎng)基吸出后加入199 μL新鮮培養(yǎng)基和1 μL不同濃度樣品，每個(gè)樣品重復(fù)3孔，于5%CO2和37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后。每孔加MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心(2000 rpm，5 min)，棄上清，每孔加 DMSO 150 mL，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm的OD值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.3 體外PC12細(xì)胞抗衰老試驗(yàn)

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用25 mmol/L的NaN3處理PC12 4h作為誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的方式。用胰酶將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞消化，用DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋為5×104個(gè)/mL，每孔190 μL接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，加入1 mol/L的NaN3處理液10 μL，處理24 h，用DMEM培養(yǎng)基將樣品稀釋到不同濃度的樣品溶液(2、10和40 mg/mL，吸出培養(yǎng)基，每孔加入含有血清的DMEM培養(yǎng)液199 μL，然后加入1 μL不同濃度的樣品，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后，按1.2.3.2MTT試驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

以SPSS 13.0軟件包對(duì)所獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果差異的顯著性檢驗(yàn)通過(guò)ANOVA方差檢驗(yàn)完成，顯著性設(shè)定為*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除超氧陰離子試驗(yàn)結(jié)果

圖1表明，200 mg/mL桑黃、樺褐孔菌和靈芝醇提物清除超氧陰離子的能力［96.11% ±0.30%、75.92% ±0.77%和65.60% ±6.66%(表1)］分別位于前三位，而杏鮑菇、姬松茸、灰樹(shù)花和蛹蟲(chóng)草醇提物［42.23% ±3.06%、34.81% ±1.12%、40.16% ±2.70%和40.63% ±0.61%(表1)］的清除超氧陰離子能力較為相近，其余的食用菌(猴頭，6.24% ±2.05%;香菇，14.36% ±2.34%;雞腿菇，7.92% ±3.19%)則較弱或沒(méi)有。

圖1 十種食用菌醇提物對(duì)超氧陰離子的清除率Fig.1 Superoxide anion scavenging activities of ethanol extracts of ten edible/medicinal fungi

2.2 清除過(guò)氧化氫試驗(yàn)結(jié)果

圖2表明，2000 μg/mL桑黃、樺褐孔菌和靈芝均具有較強(qiáng)的清除過(guò)氧化氫能力［99.31% ±0.03%、97.51% ±0.05%和71.01% ±0.79%(表1)］，并且桑黃的清除效果最好，而雞腿菇、灰樹(shù)花和蛹蟲(chóng)草醇提物［53.39% ±5.05%、39.17% ±1.84%和48.61% ±2.23%(表2)］的清除過(guò)氧化氫能力較為相近，其余的食用菌(猴頭，29.82% ±5.68%;香菇，32.51% ±7.80%;姬松茸，21.49% ±0.99%;杏鮑菇，21.15% ±7.26%)則較弱或沒(méi)有。

2.3 體外PC12細(xì)胞氧化損傷試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明在十種食用菌中，與非細(xì)胞水平抗氧化結(jié)果相似，200 μg/mL桑黃、樺褐孔菌和靈芝的醇提物對(duì)PC12細(xì)胞損傷有良好的保護(hù)作用(0.868±0.078、0.270±0.004和0.261% ±0.013%)

圖2 十種食用菌醇提物對(duì)H2O2的清除率Fig.2 H2O2scavenging activities of ethanol extracts of ten edible/medicinal fungi

表1 十種食用菌醇提物對(duì)超氧陰離子和過(guò)氧化氫的清除率Table 1 Superoxide anion and H2O2scavenging activities of ethanol extracts of ten edible/medicinal fungi

(表2)，其中桑黃的效果最好，而其它食用菌醇提物(杏鮑菇，0.198 ±0.005;雞腿菇，0.206 ±0.017;姬松茸，0.185±0.003;香菇，0.190±0.010;灰樹(shù)花，0.201±0.011;蛹蟲(chóng)草，0.185±0.002;猴頭，0.186±0.001)無(wú)明顯效果(圖3)。

圖3 十種食用菌醇提物對(duì)PC12細(xì)胞的氧化損傷保護(hù)作用Fig.3 Antioxidant activities of ethanol extracts of ten edible/medicinal fungi on PC12

2.4 體外PC12細(xì)胞抗衰老試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在此模型中200 μg/mL桑黃與以上試驗(yàn)結(jié)果相同，具有最好的抗細(xì)胞衰老效果(1.419 ±0.070)(表2)，而 200 μg/mL 樺褐孔菌和靈芝的功效較為相近(0.693±0.036和0.701±0.031)(表2)，這與H2O2損傷的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，而與非細(xì)胞水平抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同(圖4)。

圖4 十種食用菌醇提物對(duì)NaN3誘導(dǎo)PC12細(xì)胞衰老的修復(fù)作用Fig.4 Anti-aging activities of ethanol extracts of ten edible/medicinal fungi on PC12

表2 十種食用菌醇提物對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷和衰老的修復(fù)作用Table 2 Antioxidant and anti-aging activities of ethanol extracts of ten edible/medicinal fungi on PC12

損傷組 Injury group 0．183 ±0．001 0．326 ±0．004杏鮑菇Pleurotus eryngii 10 0．190 ±0．004 0．316 ±0．004 50 0．191 ±0．002 0．318 ±0．004 200 0．198 ±0．005 0．323 ±0．010雞腿菇Coprinus comatus 200 0．183 ±0．002 0．423 ±0．028 500 0．188 ±0．003 0．515 ±0．062 2000 0．206 ±0．017 0．701 ±0．031姬松茸Agaricus blazei 200 0．182 ±0．005 0．254 ±0．002 500 0．185 ±0．002 0．337 ±0．005 2000 0．185 ±0．003 0．392 ±0．021香菇Lentinula edodes 200 0．181 ±0．003 0．334 ±0．013 500 0．187 ±0．006 0．340 ±0．006 2000 0．190 ±0．010 0．359 ±0．008樺褐孔菌Inonotus obliquus 200 0．187 ±0．001 0．433 ±0．017 500 0．196 ±0．003 0．471 ±0．024 2000 0．270 ±0．004 0．693 ±0．036桑黃Phellinus baumii 200 0．206 ±0．006 0．935 ±0．093 500 0．366 ±0．007 1．241 ±0．036 2000 0．868 ±0．078 1．419 ±0．070靈芝Ganoderma lingzhi 200 0．195 ±0．002 0．423 ±0．028 500 0．194 ±0．001 0．515 ±0．062 2000 0．261 ±0．013 0．701 ±0．031灰樹(shù)花Grifola frondosa 200 0．193 ±0．002 0．325 ±0．002 500 0．198 ±0．002 0．329 ±0．003 2000 0．201 ±0．011 0．335 ±0．009蛹蟲(chóng)草Cordyceps militaris 200 0．180 ±0．002 0．324 ±0．009 500 0．183 ±0．004 0．334 ±0．002 2000 0．185 ±0．002 0．369 ±0．007猴頭Hericium erinaceus 200 0.186±0.002 0.285±0.023 500 0.188±0.001 0.398±0.033 2000 0.186±0.001 0.409±0.023

2.5 小結(jié)

桑黃、樺褐孔菌和靈芝三種食藥用菌對(duì)超氧陰離子和過(guò)氧化氫自由基表現(xiàn)出良好的清除效果，并且對(duì)PC12細(xì)胞的氧化損傷具有較好的修復(fù)作用，說(shuō)明這三種食藥用菌在非細(xì)胞水平和細(xì)胞水平上均有良好的抗氧化能力。同時(shí)，對(duì)十種食藥用菌的抗細(xì)胞衰老能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這三種食藥用菌的抗衰老能力明顯好于其他幾種食藥用菌。以上研究結(jié)果提示桑黃、樺褐孔菌和靈芝具有良好的抗氧化和延緩衰老的雙重功效。

3 討論

衰老(aging，senescence)又稱老化，通常是指在正常狀況下生物發(fā)育成熟后，隨年齡增加，自身機(jī)能減退，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應(yīng)激能力下降，結(jié)構(gòu)、組分逐步退行性變，趨向死亡的不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子免疫學(xué)等邊緣學(xué)科的飛速發(fā)展，人們對(duì)衰老的機(jī)制有了深層次的認(rèn)識(shí)，并在大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)的基礎(chǔ)上提出了許多新的學(xué)說(shuō)，分別從不同的角度探討了衰老發(fā)生的機(jī)制和對(duì)策。在這些衰老學(xué)說(shuō)中，以自由基學(xué)說(shuō)最受重視，支持這一理論的實(shí)驗(yàn)證據(jù)也最為豐富。機(jī)體較弱的抗氧化能力，會(huì)導(dǎo)致組成體內(nèi)細(xì)胞受到自由基的攻擊，從而引起細(xì)胞損傷，并導(dǎo)致機(jī)體快速衰老。利用疊氮鈉誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型可在細(xì)胞水平評(píng)價(jià)待測(cè)物質(zhì)的抗衰老能力。本研究以自由基學(xué)說(shuō)作為研究基礎(chǔ)，從食用菌中尋找具有抗氧化活性的品種，并利用PC12細(xì)胞衰老模型進(jìn)行驗(yàn)證。在本實(shí)驗(yàn)中，桑黃、樺褐孔菌和靈芝均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，但桑黃的效果在兩項(xiàng)試驗(yàn)中均要好于后兩種食用菌，并且在高濃度(2000 μg/mL)接近VC陽(yáng)性對(duì)照清除效果。桑黃在抗細(xì)胞衰老試驗(yàn)中也表現(xiàn)出最好的抗衰老效果。

在前期的實(shí)驗(yàn)中，我們比較了桑黃水提物和醇提物在非細(xì)胞和細(xì)胞水平上抗氧化和抗衰老效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，醇提物的活性明顯高于水提物。進(jìn)一步通過(guò)正丁醇萃取獲得的萃取相其抗衰老活性得到了明顯提高，這一結(jié)果表明桑黃子實(shí)體中起到抗氧化和抗衰老活性的主要是小分子化合物［8］。桑黃子實(shí)體小分子主要為黃酮及其衍生物、香豆素類、角醇類等，莫順燕等首次從桑黃中分離得到5個(gè)黃酮和2個(gè)香豆素類化合物，分別為袖皮素、櫻花亭、二氫莰非素、7-甲氧基二氫茨非素、北美圣草素、香豆素及蓖若亭，后來(lái)又分離得到個(gè)新的二氫黃酮衍生物，分別為5，7，4'-三經(jīng)基鄰羥芐基二氫黃酮和5，7，4'-三羥基-6-鄰羥芐基二氫黃酮［9］。已有研究表明黃酮類、香豆類和角醇類化合物均具有一定的抗氧化和抗衰老效果，因而在后續(xù)的研究中需要通過(guò)分離純化的方法從桑黃醇提物中獲得單一化合物，通過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)尋找有效物質(zhì)，并闡明其作用機(jī)理。

目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上食用菌的功能食品主要集中于提高免疫力的多糖類保健品，除了靈芝三萜類產(chǎn)品以外，對(duì)食用菌小分子產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)基本還處于空白領(lǐng)域。衰老是所有人都無(wú)法避免的正常生理現(xiàn)象，隨著人們對(duì)自身健康的不斷關(guān)注，為延緩衰老功能食品的開(kāi)發(fā)提供了廣闊的市場(chǎng)前景。本研究的對(duì)象為市場(chǎng)上最為常見(jiàn)的10種食藥用真菌，從中篩選出具有抗良好氧化和抗衰老功效的桑黃對(duì)功能食品開(kāi)發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

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