易清清，劉玲艷，馮 磊，邱麗穎

江南大學(xué)藥學(xué)院，無(wú)錫 214122

合歡皮為豆科植物合歡Albizia julibrissin Durazz的干燥樹皮，藥典記載其具有解郁安神、活血消腫的作用，可用于治療心神不安、憂郁失眠、肺癰瘡腫、跌撲傷痛［1，2］。相關(guān)研究表明合歡皮中含有以下藥理成分，如三萜、生物堿、黃酮、木脂素等，有鎮(zhèn)靜、抗菌、抗生育、抗腫瘤等作用［3］。合歡皮作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，其資源豐富，皂苷含量高，結(jié)構(gòu)新穎復(fù)雜，抗癌活性顯著［4］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，合歡皮水煎液具有抗腫瘤血管新生的活性［5，6］，也對(duì)其提取工藝［7］進(jìn)行了初步研究。為了促使其成藥性，以血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1為篩選模型，通過(guò)對(duì)不同工藝得到的組分的活性和毒性測(cè)定，從而篩選出最理想的高效低毒組分，并對(duì)其進(jìn)行初步的藥效學(xué)研究。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

合歡皮購(gòu)自無(wú)錫山禾集團(tuán)中藥飲片有限公司，南京中醫(yī)藥大學(xué)陳健偉教授鑒定為Albizia julibrissin Durazz的干燥樹皮。MCDB細(xì)胞培養(yǎng)基(Sigma公司，美國(guó))，小牛血清(上海冠羽生物科技有限公司)，Multiskan MK3自動(dòng)酶標(biāo)儀(Labsystem公司，美國(guó))，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO公司，美國(guó))，胎牛血清(上海洛神生物技術(shù)有限公司)，青霉素(華北制藥股份有限公司)，鏈霉素(大連美羅大藥廠)，Matrigel matrix(BD公司，美國(guó))。

1.2 細(xì)胞株

SV40病毒轉(zhuǎn)染的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)傳代株由法國(guó)國(guó)家衛(wèi)生醫(yī)學(xué)研究院U553研究所(INSERM U553)陸核教授饋贈(zèng)，保存于液氮罐中;SV40病毒轉(zhuǎn)染的小鼠淋巴瘤內(nèi)皮細(xì)胞傳代株(3B11)由美國(guó)Scripp研究所周泉生教授饋贈(zèng)，保存于液氮罐中;H22肝癌瘤株來(lái)源于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理學(xué)研究室。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR健康雄性小鼠(上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，SCXK(浙)20080033)80只，鼠齡4～5周，體質(zhì)量(25±2)g。飼養(yǎng)溫度25℃，相對(duì)濕度55%。

2 方法步驟

2.1 提取分離組分1～24

2.1.1 原料藥制備:稱取100 g合歡皮，加入1 L去離子水，煮沸后文火煮1.5 h，共兩次，過(guò)濾，合并兩次水煮液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到原料藥。

2.1.2 按極性萃取:取凍干粉500 mg，溶于100 ml去離子水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇萃取3次，得到各有機(jī)相標(biāo)記為組分1，2，3和4，水相為5。

2.1.3 按目標(biāo)產(chǎn)物萃取:將兩次原料藥水煮液濃縮至300 ml，加無(wú)水乙醇至終濃度95%，4℃靜置24 h后過(guò)濾，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，水復(fù)溶后冷凍干燥得凍干粉。路線1:取凍干粉1 g，100 ml純水溶解，滴加10%NaOH至PH=9～10，氯仿萃取3次，水相中滴加2%HCL至PH=7，水飽和正丁醇萃取3次，收集有機(jī)相和水相(標(biāo)記為組分6，7，8)。路線2:取凍干粉1 g，100 ml純水溶解，滴加2%HCL至PH=3～4，氯仿萃取3次，水相中滴加10%NaOH至PH=7，水飽和正丁醇萃取3次，收集有機(jī)相和水相(標(biāo)記為組分9，10，11)。路線3:取凍干粉 1 g，100 mL純水溶解，水飽和正丁醇萃取3次，收集有機(jī)相和水相(標(biāo)記為組分12，13)。

2.1.4 大孔樹脂法分離:醇溶凍干粉50 mg溶于25 mL超純水中，藥液上柱預(yù)吸附2 h，依次用水，30%、50%、70%乙醇梯度洗脫，每個(gè)濃度洗3倍柱體積，流速1.5 mL·min-1，收集水洗脫組分及30%、50%、70%乙醇洗脫組分(標(biāo)記為組分14，15，16，17)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥。

2.1.5 簡(jiǎn)化工藝分離:取原料藥凍干粉1 g，100 mL水溶解，先用石油醚等體積萃取3次，再用正丁醇萃取5次，收集有機(jī)相和水相(標(biāo)記為組分18，19，20)。醇溶凍干粉水溶液用水飽和正丁醇等體積萃取5次，收集有機(jī)相和水相(標(biāo)記為21，22)。稱取100 g合歡皮，加入1 L 70%乙醇，回流2次，每次2～2.5 h，水煮液過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，去離子水復(fù)溶，凍干，取凍干粉1 g，100 mL水溶解，水飽和正丁醇萃取3次，收集正丁醇相和水相(標(biāo)記為23，24)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HMEC-1細(xì)胞用含1 mmol/L谷氨酰胺、10 μg·L-1EGF和100 ml·L-1小牛血清的MCDB-131培養(yǎng)液，于37 ℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

3B11用含1 mmol/L谷氨酰胺、100 U/L雙抗和100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)［8］。

2.3 SRB實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HMEC-1細(xì)胞，每孔8000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，放置于37℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的組分1～24作用48 h，以不加藥組為陰性對(duì)照組，加藥后培養(yǎng)至72 h測(cè)板，用MK3型酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)A540處測(cè)定每孔A值。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期3B11細(xì)胞，每孔4000～5000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，放置于37℃、50 ml·L-1CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的組分23作用48 h，以不加藥組為陰性對(duì)照組，加藥后培養(yǎng)至72 h測(cè)板，用MK3型酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)A540處測(cè)定每孔A值。

2.4 細(xì)胞毒評(píng)價(jià)

嚴(yán)格按照LDH測(cè)定試劑盒，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定取樣量20 μL，對(duì)每個(gè)有活性組分進(jìn)行測(cè)定，以出現(xiàn)活性增加的最小有效濃度作為評(píng)價(jià)毒性的濃度。

2.5 組分化學(xué)定性［9］

采用典型的化學(xué)定性方法:碘一碘化鉀試劑，磷鉬酸試劑來(lái)檢測(cè)有無(wú)生物堿，泡沫試驗(yàn)，乙酸酐—濃硫酸反應(yīng)檢測(cè)有無(wú)皂苷，鹽酸-鎂粉反應(yīng)，堿液試驗(yàn)檢查黃酮類化合物。

2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

用劃線灼傷法研究細(xì)胞遷移，在100×顯微鏡下拍同一視野處0 h和48 h細(xì)胞遷移圖，所得圖片用IPWin60C軟件圖象軟件進(jìn)行處理，測(cè)量灼傷帶距離，計(jì)算遷移率(100%)，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果用±s表示。

2.7 細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前12 h將Matrigel置于4℃下融化，實(shí)驗(yàn)時(shí)將24孔板放置冰上，Matrigel按150 μL/孔鋪板，37℃，50 Ml/L CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育30 min。然后將組分23按不同濃度與細(xì)胞懸液等體積混勻，并設(shè)置對(duì)照組，37℃、50 mL/LCO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育12 h，每隔一段時(shí)間進(jìn)行拍照。

2.8 急性毒性測(cè)定

最小致毒量觀察:組分23以50，75，100 mg·kg-1的劑量分組給藥，每個(gè)劑量間隔5～7 d，每個(gè)劑量5只ICR小鼠，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組。觀察體重、飲食、飲水等指標(biāo)，與對(duì)照組比較，其中有指標(biāo)出現(xiàn)異常，此劑量即定為最小致毒量。

最小致死量觀察:組分23以1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000 mg·kg-1的劑量分組給藥，每個(gè)劑量間隔5～7 d，每個(gè)劑量5只ICR小鼠，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組。以5只小鼠出現(xiàn)1只死亡為準(zhǔn)，此劑量即定為近似致死量。

2.9 腫瘤小鼠模型的建立

取小鼠H22肝癌細(xì)胞腹腔內(nèi)接種7 d的小鼠，無(wú)菌條件下抽取腹水，用0.9%生理鹽水稀釋4倍(細(xì)胞懸液置于冰上)，用1 mL無(wú)菌注射器分別于每只小鼠右腋皮下接種0.2 mL，整個(gè)過(guò)程在半小時(shí)內(nèi)完成。動(dòng)物造模右腋下接種作為實(shí)體瘤小鼠。

分組:正常鼠10只，接種后的實(shí)體瘤小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、組分23給藥低、中、高3個(gè)劑量組，每組10只。于24 h后灌胃給藥。給藥劑量為:低劑量組2 mg·(kg·d)-1，中劑量組4 mg·(kg·d)-1，高劑量組 8 mg·(kg·d)-1，持續(xù)給藥 14 d，每天1次。正常組與模型對(duì)照組給予生理鹽水。

3 結(jié)果與討論

3.1 各組分細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果

前期實(shí)驗(yàn)測(cè)定原料藥對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞達(dá)到半數(shù)抑制率時(shí)的濃度 30 μg·mL-1［5］，所以本實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)濃度(3、30、60 μg·mL-1)對(duì)其活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。其中，給藥濃度為30 μg·mL-1時(shí)抑制率超過(guò)50%的有組分 4(71.90% ±2.45%)、7(79.56% ±3.18%)、10(72.84% ± 2.24%)、12(84.55% ±1.20%)、16(63.76% ± 3.18%)、17(86.83% ±1.57%)、19(63.41% ± 0.92%)、21(84.55% ±1.20%)、23(65.81% ±1.71%)，視為有活性組分。

3.2 高效低毒組分篩選結(jié)果

根據(jù)3.1的活性篩選結(jié)果，進(jìn)一步計(jì)算活性組分達(dá)到半數(shù)抑制率(IC50)時(shí)的濃度，通過(guò)表1中IC50和致LDH陽(yáng)性反應(yīng)的濃度，得到3個(gè)較為理想的組分，分別為組分19、21、23，其中最理想的組分為23。

表1 活性組分對(duì)HMEC-1細(xì)胞的IC50和致LDH陽(yáng)性反應(yīng)的濃度(n=5，±s)Table 1 the IC50and the concentration iducing LDH positive response of active component in the HMEC-1 cells(n=5，±s)

表1 活性組分對(duì)HMEC-1細(xì)胞的IC50和致LDH陽(yáng)性反應(yīng)的濃度(n=5，±s)Table 1 the IC50and the concentration iducing LDH positive response of active component in the HMEC-1 cells(n=5，±s)

組分Components 47 10 12 16 17 19 21 23 IC50μg·mL-1 7.82±0.767.91±0.338.25±1.156.96±0.1924.19±1.645.40±0.588.12±0.766.96±0.19 4.18±0.37致LDH陽(yáng)性反應(yīng)濃度μg·mL-120 20 20 30 20 20 20 30 40

3.3 組分定性結(jié)果

從表2可以看出，3個(gè)有效組分的皂苷檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均呈陽(yáng)性，主要成分為皂苷。

表2 定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of qualitative tests

3.4 組分23對(duì)HMEC-1細(xì)胞遷移能力的影響

通過(guò)比較對(duì)照組和給藥組灼傷距離來(lái)判斷遷移能力。與對(duì)照組相比，10 μg·mL-1和 20 μg·mL-1的組分23均能明顯抑制HMEC-1細(xì)胞，對(duì)照組的遷移率為84.37±1.30%，組分23兩個(gè)濃度的遷移率分別為65.01±4.58%、47.88±8.16%，表明組分23對(duì)HMEC-1細(xì)胞的遷移具有顯著的抑制作用(P＜0.01)。

圖1 不同濃度組分23對(duì)HMEC-1細(xì)胞遷移的影響Fig.1 Effects of different concentrations of component 23 on HMEC-1 cell migration

3.5 組分23對(duì)HMEC-1細(xì)胞成管能力的影響

從圖2可以看出，對(duì)照組細(xì)胞成管狀態(tài)良好，管腔清晰可見，而給藥后與對(duì)照組相比成管面積明顯減少，表明組分23具有顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞成管的作用。

圖2 不同濃度組分23對(duì)HMEC-1細(xì)胞成管的影響Fig.2 Effects of different concentrations of component 23 on tube formation of HMEC cells

3.6 組分23在3B11細(xì)胞上的評(píng)價(jià)

3.6.1 組分23對(duì)3B11細(xì)胞的IC50

組分23在3B11細(xì)胞上的IC50為7.78±0.96 μg·mL-1，表明3B11細(xì)胞對(duì)組分23的敏感性低于HMEC-1細(xì)胞(P＜0.05)。

3.6.2 組分23對(duì)3B11細(xì)胞遷移能力的影響

圖 3 中 20 μg·mL-1和 40 μg·mL-1的組分 23均能明顯抑制3B11細(xì)胞的遷移，對(duì)照組的遷移率為90.18±1.74%，組分23兩個(gè)濃度的遷移率分別為50.12±5.43%、35.32±5.46%，表明組分23對(duì)3B11細(xì)胞的遷移具有顯著的抑制作用(P＜0.01)。

圖3 不同濃度組分23對(duì)3B11細(xì)胞遷移的影響Fig.3 Effects of different concentrations of component 23 on 3B11 cell migration

3.6.3 組分23對(duì)3B11細(xì)胞成管的影響

從圖4可以看出，給藥后很多管腔出現(xiàn)斷裂，成管面積顯著減少，表明組分23具有顯著抑制3B11細(xì)胞成管的作用。

圖4 不同濃度組分23對(duì)3B11細(xì)胞成管的影響Fig.4 Effects of different concentrations of component 23 on tube formation of 3B11 cells

3.7 組分23最小致死量和最小致毒量結(jié)果

組分23的最小致毒量為100 mg·kg-1，最小致死量為4000 mg·kg-1，說(shuō)明最大耐受量和最小致毒劑量之間跨度范圍比較大，臨床使用安全性比較高。

3.8 組分23對(duì)H22荷瘤小鼠瘤重的影響

各組H22小鼠腫瘤如圖5、表3所示，與對(duì)照組比較，高、中劑量組抑瘤率＞30%，低劑量組抑瘤率＜30%，其中高劑量組抑瘤率最高。

圖5 各組H22小鼠腫瘤大小Fig.5 The tumor size in each group of H22 mice

表3 各組H22小鼠瘤重及抑瘤率Table 3 The tumor weight and tumor inhibiting rate of H22 mice in each group

3.9 組分23對(duì)H22荷鼠腫瘤新生血管的影響

通過(guò)免疫組化染色，細(xì)胞凋亡檢測(cè)，顯微鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)視野取平均值，結(jié)果如表4，由表可見，與模型對(duì)照組相比，中高劑量組CD31蛋白標(biāo)志腫瘤血管數(shù)明顯降低，低、中、高劑量組腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)目均增高。

表4 各組指標(biāo)的比較Table 4 Comparison of the various groups of indicators

3.10 討論

腫瘤的生長(zhǎng)分為2個(gè)明顯的階段:無(wú)血管期和血管期，在無(wú)血管期實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)主要靠滲透獲得營(yíng)養(yǎng)，直徑不會(huì)超過(guò)2 mm，并且沒有轉(zhuǎn)移能力，一旦進(jìn)入血管期，血管的生成就使腫瘤獲得足夠的血供和營(yíng)養(yǎng)，而且由于新生血管的基底膜不完整，血管通透性高，腫瘤細(xì)胞極易穿透血管壁而發(fā)生轉(zhuǎn)移［10］。因此，抑制腫瘤血管生成是治療腫瘤的一種重要方法。血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管發(fā)生中具有重要作用，通過(guò)抑制它的增殖可以抑制腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤的惡性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［11，12］。所以，利用血管生成抑制劑可以特異性地抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和活性，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移而不影響其他正常細(xì)胞［13］。目前國(guó)外藥物研究發(fā)現(xiàn)阿瓦斯汀，血管生成抑制素和內(nèi)皮抑素有明顯的抗腫瘤血管生成作用，但是這3種都屬于多肽類藥物，穩(wěn)定性較差，不能口服給藥，而且用藥劑量較大，治療時(shí)間長(zhǎng)，這些都直接或間接地增加了患者的負(fù)擔(dān)。所以我們有必要發(fā)揮中國(guó)自己的優(yōu)勢(shì)，從天然產(chǎn)物、中藥材中篩選到用藥劑量小、可以口服給藥、藥效等于或優(yōu)于以上3種抗腫瘤新生血管的藥物。

本研究室多年來(lái)一直從事從天然產(chǎn)物、中藥材中篩選出用藥劑量小、可以口服給藥、藥效較好的抗腫瘤新生血管藥物。前期已從合歡皮中分離得到了合歡皮總皂苷提取物，并對(duì)其進(jìn)一步分離純化得到了合歡皮抑制腫瘤血管生成的單體化合物，J8和J12。經(jīng)體內(nèi)、外藥效學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，已提取的有效組分和單體可有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制腫瘤生長(zhǎng)，目前本研究室已經(jīng)為該研究申報(bào)專利，擁有獨(dú)立的知識(shí)產(chǎn)權(quán)［14，15］。前期工作雖然已經(jīng)提取到有效的抗腫瘤新生血管的組分和單體，但是毒性大安全范圍較小。所以本研究以提取分離高效低毒的有效組分為目標(biāo)，通過(guò)按極性萃取原料藥、按目標(biāo)產(chǎn)物萃取原料藥、大孔樹脂法分離原料藥、簡(jiǎn)化工藝分離原料藥共獲得24個(gè)組分，然后以HMEC-1細(xì)胞為篩選模型，從組分1～24中篩選出高效低毒組分23，化學(xué)成分定性主要為皂苷，并初步探索組分23的體內(nèi)外藥效、毒理學(xué)相關(guān)指標(biāo)，為申報(bào)中藥第五類新藥提供材料。此外，本文沒有研究活性組分23在體內(nèi)作用的相關(guān)靶蛋白及其作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

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