唐 文

上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院食品科學(xué)系，上海 201418

靈芝是一種珍貴的藥用真菌，具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗HIV病毒、免疫調(diào)節(jié)等。靈芝酸是靈芝中主要的三萜類生物活性成分，自Toth等［1］首先報(bào)道了靈芝三萜類化合物的抗癌活性以來，已對(duì)其進(jìn)行了較深入的研究。前期研究表明:多種靈芝酸能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，限制細(xì)胞周期，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡［2］，并提出了靈芝酸誘導(dǎo)凋亡的途徑是與p53蛋白相關(guān)的依賴于線粒體的內(nèi)源性凋亡途徑［3］。

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性是導(dǎo)致癌癥治療無效的常見原因之一。一般認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性有兩方面原因［4］:一是干擾了腫瘤細(xì)胞的凋亡過程;二是細(xì)胞表面載體使抗癌藥物被排斥或排出細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)藥物積累量減少。在多藥耐藥性研究中，主要介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白是P-糖蛋白(P-gp)，多藥耐藥性相關(guān)蛋白(MRP)、抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)等。有研究表明一些來源于植物的三萜類物質(zhì)具有逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的多藥耐藥性作用，如紅參中的人參皂甙Rg3［5］。但關(guān)于靈芝酸逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的研究還未見報(bào)道。

本研究目的是初步研究靈芝三萜類(靈芝酸T)增加多藥耐藥性KB-A-1/Dox細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性的效果及其可能的作用機(jī)理，從而為靈芝酸作為輔助腫瘤化療的保健品研究或逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性藥物的先導(dǎo)化合物研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

細(xì)胞株:KB-A-1和KB-A-1/Dox是人口腔表皮癌耐藥細(xì)胞，由華東理工大學(xué)藥學(xué)院劉建文教授實(shí)驗(yàn)室提供。靈芝酸T(純度＞99%)為本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)酵培養(yǎng)靈芝干燥菌絲體中經(jīng)制備色譜分離提取獲得，經(jīng)核磁譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)鑒定。噻唑藍(lán)［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT］，RPMI 1640 培養(yǎng)基、小牛血清，碘化丙啶(PI)購于華美生物技術(shù)有限公司。阿霉素(Dox)，Rhodamin123購于 Sigma公司。酶標(biāo)儀(Bio-Rad，USA);CO2培養(yǎng)箱(Heraeus，USA);熒光分光光度計(jì)(Shimadzu，Japan);流式細(xì)胞儀(BD Bioscience，USA);液相色譜及熒光檢測(cè)器(Shimadzu，Japan)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

KB-A-1和KB-A-1/Dox細(xì)胞置5%CO2培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)。培養(yǎng)基為EMEM高糖培養(yǎng)基，添加12%的小牛血清。KB-A-1/Dox細(xì)胞需要在培養(yǎng)基中添加阿霉素(Dox)維持耐藥性，阿霉素濃度為0.75 μM。

1.3 腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的誘導(dǎo)和維持

方法［6］，接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 KB-A-1細(xì)胞，培養(yǎng)基中加入0.1 μM的阿霉素誘導(dǎo)5代，以后逐漸增加阿霉素的添加量。至90 d后，KB-A-1細(xì)胞可以在含0.75 μM阿霉素的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)增殖，停藥后2 w，凍存細(xì)胞，以此KB-A-1/Dox細(xì)胞為耐藥性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)，未經(jīng)阿霉素誘導(dǎo)的KB-A-1細(xì)胞為對(duì)照腫瘤細(xì)胞。

1.4 抑制細(xì)胞增殖能力的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)方法如參考文獻(xiàn)［7］所示。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1×105cell/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2 mL，分別加入 0、10、50、100、150 μg/mL 濃度的靈芝酸T處理，對(duì)照組加等量體積的培養(yǎng)液，置37°C，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)終止前4 h 每孔加入5 μg/mL MTT 10 μL，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入 0.04 M DMSO 200 μL，振蕩保溫 15 min，待MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用BioRad 550型酶標(biāo)儀，以550 nm為實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)，655 nm為參照波長(zhǎng)測(cè)定其吸收度，計(jì)算細(xì)胞的抑制率，并以藥物的不同濃度和細(xì)胞的抑制率作圖，確定細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，取平均值。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡

實(shí)驗(yàn)方法如參考文獻(xiàn)所示［3］，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)4 h后，加入 0、50、100 μg/mL 靈芝酸 T 作用24h后，經(jīng)胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞(1500 rpm×10 min)，PBS洗滌2遍，以PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL，加入 RNase，終濃度為 100 U/mL，37 °C保溫30 min，加入PI等熒光試劑，終濃度為50 μg/mL，在常溫下暗反應(yīng)30 min，然后200目濾膜過濾，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析凋亡，每次記錄1000個(gè)細(xì)胞。

1.6 細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量的檢測(cè)

根據(jù)參考文獻(xiàn)用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)［8］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種在24孔板中，濃度為105個(gè)/mL，細(xì)胞在0.5 μM 阿霉素和5 μg/mL 靈芝酸聯(lián)合作用下處理4 h，對(duì)照為不加靈芝酸的細(xì)胞。處理后的細(xì)胞用冷PBS洗滌三次后，懸浮細(xì)胞，統(tǒng)一各組細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，加入0.5 mL水，反復(fù)凍融3次，12000 rpm離心30 min，上清用于阿霉素檢測(cè)。分析條件為:檢測(cè)器為熒光監(jiān)測(cè)器，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為495 nm和560 nm。流動(dòng)相為5 μM的磷酸/甲醇/乙腈/異丙醇:8∶7∶2∶3，使用前用0.45 μM的濾膜過濾，流速為0.8 mL/min。用已知濃度的阿霉素作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 Rhodamine 123在細(xì)胞內(nèi)含量分析

根據(jù)參考文獻(xiàn)用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)［9］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種在24孔板中，濃度為每孔106個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞首先培養(yǎng)4 h，然后加入靈芝酸和阿霉素，孵育4 h，對(duì)照為不加靈芝酸處理的細(xì)胞。加入Rhodamine123，濃度為20 μM，繼續(xù)培養(yǎng) 60 min。處理后的細(xì)胞以冷PBS洗滌3次，加入0.5 mL水，懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度保持一致(1×105個(gè)/mL)，反復(fù)凍融3次，12000 rpm離心30 min，上清液用于Rhodamine 123熒光檢測(cè)。熒光分光光度計(jì)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為485 nm和530 nm。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著差異性分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，在P＜0.05水平和P＜0.01水平下判斷其顯著差異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 靈芝酸T抑制KB-A-1和KB-A-1/Dox細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡

圖1 靈芝酸T對(duì)KB-A-1和KB-A-1/Dox細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用Fig.1 Cytotoxic effect of ganoderic acid T on KB-A-1 and KB-A-1/Dox cells

從靈芝酸T對(duì)阿霉素敏感腫瘤細(xì)胞KB-A-1和耐藥性腫瘤細(xì)胞KB-A-1/Dox的細(xì)胞毒性結(jié)果可以看出(圖 1)，在 150 μg/mL的藥物濃度下，超過80%的細(xì)胞被抑制生長(zhǎng)，IC50值均約為50 μg/mL，對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的IC50分析表明沒有顯著性差異(p＜0.01)。結(jié)果表明靈芝酸對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，KB-A-1/Dox細(xì)胞的多藥耐藥性并未影響靈芝酸T作用效果。

腫瘤細(xì)胞的凋亡分析表明:靈芝酸T顯著地誘導(dǎo)阿霉素敏感腫瘤細(xì)胞KB-A-1和耐藥性腫瘤細(xì)胞KB-A-1/Dox的凋亡(圖2)。在藥物濃度從50 μg/mL增加到100 μg/mL的情況下，細(xì)胞凋亡率從20%增加到80%。結(jié)合圖1結(jié)果，說明靈芝酸T可通過誘導(dǎo)凋亡抑制多藥耐藥型腫瘤細(xì)胞的增殖。

圖2 靈芝酸T誘導(dǎo)KB-A-1 and KB-A-1/Dox細(xì)胞的凋亡Fig.2 Apoptosis of KB-A-1 and KB-A-1/Dox cells induced by ganoderic acid T

圖3 靈芝酸T影響KB-A-1 and KB-A-1/Dox細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性Fig.3 Effects of ganoderic acid T on inhibitory activity of KBA-1 and KB-A-1/Dox cells against doxorubicin(DOX)

2.2 靈芝酸T增加多藥耐藥性KB-A-1/Dox細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性

圖3表明在具有阿霉素抗性的KB-A-1/Dox細(xì)胞過程培養(yǎng)中，添加5 μg/mL靈芝酸T能顯著增加阿霉素的細(xì)胞毒性。添加靈芝酸T后，阿霉素對(duì)多藥耐藥性細(xì)胞作用的IC50值減少到 0.103 μg/mL，與阿霉素對(duì)照組的IC502.294 μg/mL相比，細(xì)胞毒性增加了22.3倍。而5 μg/mL的靈芝酸T處理沒有改變阿霉素敏感細(xì)胞株KB-A-1對(duì)阿霉素的敏感性，對(duì)照和處理組沒有顯著性差異。

圖4 靈芝酸T提高KB-A-1/Dox細(xì)胞中阿霉素含量Fig.4 The concentration of DOX in KB-A-1/Dox cells under treatment of ganoderic acid T

2.3 靈芝酸T提高KB-A-1/Dox細(xì)胞內(nèi)阿霉素和Rhodanmin123的含量

圖4表明經(jīng)過靈芝酸T處理過的KB-A-1/Dox細(xì)胞均能顯著提高對(duì)阿霉素的吸收。4 μg/mL的靈芝酸處理后，可以顯著提高耐藥型腫瘤細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量。12 μg/mL的靈芝酸處理后，可以提高細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量達(dá)40%。結(jié)果表明:靈芝酸T能促進(jìn)KB-A-1/Dox細(xì)胞對(duì)阿霉素的吸收。

圖5 靈芝酸T促進(jìn)KB-A-1/Dox細(xì)胞中Rhodanmin123的積累Fig.5 The accumulation of rhodanmin123 in the KB-A-1/Dox cells under the treatment of ganoderic acid T

KB細(xì)胞系的多藥耐藥性是由于P-gp的過量表達(dá)所致［9］。P-gp的作用底物很多，如生物堿、Rhodamine123等。Rhodanmin123是一種無毒的親脂性的陽離子熒光劑，可以被P-gp介導(dǎo)的MDR細(xì)胞高效地泵出細(xì)胞。因此，觀察細(xì)胞內(nèi)的Rhodanmin123累積量，可以推測(cè)出藥物對(duì)P-gp的影響。這一方法已被多個(gè)實(shí)驗(yàn)室所采用。圖5表明靈芝酸T能增加耐藥性KB-A-1/Dox細(xì)胞內(nèi)的Rhodanmin123含量。12 μg/mL的靈芝酸T能使Rhodanmin123的累積量增加20%，而且累積效應(yīng)是劑量依賴性的。由此可以推測(cè)靈芝酸影響了P-gp的表達(dá)量(進(jìn)一步的蛋白質(zhì)和基因分析正在進(jìn)行中)，降低了P-gp介導(dǎo)的藥物泵出效應(yīng)，減少了細(xì)胞對(duì)藥物的排斥，使細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度增加。由此可以推測(cè):靈芝酸逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的機(jī)理可能與P-gp的表達(dá)相關(guān)，即它們可能是P-gp的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過降低Pgp的活性或表達(dá)量來控制藥物進(jìn)入細(xì)胞的量。

3 結(jié)論

結(jié)果表明:靈芝酸T在相對(duì)較高的濃度條件下對(duì)阿霉素敏感型和耐藥型腫瘤細(xì)胞株均有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，靈芝酸T可誘導(dǎo)兩種細(xì)胞的凋亡。阿霉素誘導(dǎo)出的多藥耐藥性未影響到靈芝酸的抑制作用。而在較低的濃度條件下，靈芝酸T可以逆轉(zhuǎn)耐藥型腫瘤細(xì)胞經(jīng)阿霉素誘導(dǎo)出的多藥耐藥性，使耐藥型腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素濃度的敏感性增加。

其次，經(jīng)5 μg/mL的低濃度靈芝酸T處理后，多藥耐藥型腫瘤細(xì)胞內(nèi)阿霉素和Rhodanmin123含量增加，提示靈芝酸T可能影響到P-gp蛋白的活性，引起細(xì)胞膜上某些載體的活性或含量發(fā)生變化，改變了細(xì)胞對(duì)藥物分子的吸收程度。

MDR抑制劑的物化性質(zhì)具有一定的普遍性，如具有共扼周期性(cyclicity)、親脂性，在生理pH條件下為中性或帶正電核物質(zhì)。靈芝酸的物化性質(zhì)與這些性質(zhì)相類似，它們以羊毛甾醇作為骨架，在分子結(jié)構(gòu)中有電子共扼體系，有強(qiáng)親脂性，在生理pH條件下中性或帶正電核的分子。所以，從物化性質(zhì)結(jié)合本文的結(jié)論看，靈芝酸可能是一種潛在的MDR抑制劑。

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