江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 李昆太 周 佳 龐會忠 葉亞健 程 新

單細(xì)胞蛋白（SCP）又稱微生物蛋白或菌體蛋白，通?？赏ㄟ^細(xì)菌、酵母菌等微生物利用食品工業(yè)及輕工業(yè)的副產(chǎn)品或下腳料發(fā)酵培養(yǎng)而得 （郭狀等，2008；許倩等，2007）。酵母菌是廣泛用于生產(chǎn)SCP的菌種，主要包括假絲酵母屬、絲孢酵母屬、漢森酵母屬和接合豆孢酵母屬等（馬旭光和張宗舟，2010）。SCP所含的營養(yǎng)物質(zhì)極為豐富，具有豐富的粗蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和促生長因子，是一類理想的蛋白質(zhì)飼料（張建剛，2010）。因此，利用非食用資源和廢棄資源開發(fā)和推廣微生物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料已成為補充飼料蛋白來源不足的重要途徑（張秋華等，2009）。甜高粱秸稈汁是一類糖含量豐富的農(nóng)副產(chǎn)品，本文以甜高粱秸稈汁為主要發(fā)酵原料，采用DPS軟件（DPS v 7.05版）的二次正交旋轉(zhuǎn)中心組合試驗設(shè)計方法對熱帶假絲酵母SG-1產(chǎn)SCP的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以期為SCP的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 甜高粱秸稈汁、工業(yè)葡萄糖、工業(yè)蛋白胨，其他無機鹽試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器 搖床、低速大容量離心機、烘箱、培養(yǎng)箱等。

1.3 菌種 熱帶假絲酵母SG-1（Candida tropicalis SG-1）：由本實驗室保存。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 斜面培養(yǎng)基 工業(yè)葡萄糖 20 g/L，工業(yè)蛋白胨 10 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41 g/L，NaC10.1 g/L，瓊脂 20 g/L；pH 自然。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分 甜高粱秸稈汁、工業(yè)葡萄糖、 工業(yè)蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4；pH 自然。

1.5 方法

1.5.1 斜面培養(yǎng) 從-20℃的冰箱中取出保藏好的甘油管菌種，接種于配制好的斜面，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 h。

1.5.2 搖瓶分批發(fā)酵 以無菌水洗下斜面上的菌體，制成菌懸液。取菌懸液1 mL接至裝量為30 mL/250 mL三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃振蕩（180 r/min）培養(yǎng)36 h。測定結(jié)果為三個平行樣的平均值。

1.6 單細(xì)胞蛋白的測定方法 吸取30 mL發(fā)酵液，4000 r/min下離心10 min，離心所得菌體以蒸餾水清洗三次后在65℃下烘干至恒重。采用凱氏定氮法測定干菌體中粗蛋白質(zhì)含量。根據(jù)公式：單細(xì)胞蛋白含量（g/L）=菌體干重（g/L）×粗蛋白質(zhì)含量，計算出發(fā)酵液中的單細(xì)胞蛋白產(chǎn)量 （高玉榮等，2010）。

2 結(jié)果與討論

以放瓶時（36 h）的SCP產(chǎn)量為考察指標(biāo)，應(yīng)用DPS軟件（DPS v 7.05版）的二次正交旋轉(zhuǎn)中心組合試驗設(shè)計方法對熱帶假絲酵母SG-1的發(fā)酵培養(yǎng)基（甜高粱秸稈汁、工業(yè)葡萄糖、工業(yè)蛋白胨、MgSO4·7H2O 和 KH2PO4）進行優(yōu)化。 試驗因素和水平設(shè)計見表1，試驗設(shè)計和結(jié)果見表2。

表1 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計因素水平表及編碼值

由表2可見，在所有試驗配方中，1號配方（即：甜高粱秸稈汁180 mL/L；工業(yè)葡萄糖 30 g/L，工業(yè)蛋白胨 30 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，KH2PO43 g/L）的SCP產(chǎn)量最高，達13.84 g/L。為了進一步探討發(fā)酵培養(yǎng)基各組分之間的交互作用以及合適的組分控制濃度，對試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可見，當(dāng)顯著水平為0.01時，X1、X2、X3這三項達均到極顯著水平，即發(fā)酵培養(yǎng)基中甜高粱秸稈汁、葡萄糖及蛋白胨的用量對熱帶假絲酵母SG-1產(chǎn)SCP影響均極顯著。對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，獲得多元二次回歸方程：

表2 熱帶假絲酵母SG-1二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計及試驗結(jié)果

式中，Y 為 SCP 的預(yù)測值；X1、X2、X3和 X4分別為甜高粱秸稈汁、工業(yè)葡萄糖、工業(yè)蛋白胨、MgSO4·7H2O 和 KH2PO4的編碼值。

由于該模型比較復(fù)雜，響應(yīng)曲面函數(shù)既沒有最大值，也沒有最小值。為了更加直觀地說明甜高粱秸稈汁、工業(yè)葡萄糖、工業(yè)蛋白胨、MgSO4·7H2O和KH2PO4對熱帶假絲酵母產(chǎn)SCP的影響以及表征響應(yīng)曲面函數(shù)的性狀，用DPS軟件作出以兩兩自變量互作效應(yīng)的三維曲面圖 （圖 1）。

圖1a顯示了甜高粱秸稈汁與葡萄糖的交互作用，發(fā)酵培養(yǎng)基中甜高粱秸稈汁與葡萄糖的濃度對熱帶假絲酵母SG-1產(chǎn)SCP的產(chǎn)量影響極顯著，二者對SCP產(chǎn)量均表現(xiàn)出正效應(yīng)；圖1b顯示了甜高粱秸稈汁與蛋白胨的交互作用，二者同樣對SCP產(chǎn)量影響極顯著且均表現(xiàn)出正效應(yīng)；圖1c顯示了甜高粱秸稈汁與無機鹽的交互作用，甜高粱秸稈汁對SCP產(chǎn)量的正作用最為顯著，而無機鹽濃度對SCP產(chǎn)量沒有表現(xiàn)出較大影響；圖1d顯示了葡萄糖與蛋白胨的交互作用，二者在試驗值范圍內(nèi)均對SCP產(chǎn)量表現(xiàn)出顯著的正效應(yīng)；圖1e顯示了葡萄糖與無機鹽的交互作用，在試驗值范圍內(nèi)，它們的交互效應(yīng)不顯著，但葡萄糖對SCP產(chǎn)量表現(xiàn)出一定的正效應(yīng)；圖1f顯示了蛋白胨與無機鹽的交互作用，在試驗值范圍內(nèi)，它們的交互效應(yīng)也不顯著，而蛋白胨對SCP產(chǎn)量表現(xiàn)出一定的正效應(yīng)。

表3 試驗數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果

以上結(jié)果可以說明，發(fā)酵培養(yǎng)基中的甜高粱秸稈汁、葡萄糖與蛋白胨用量對熱帶假絲酵母SG-1產(chǎn)SCP的影響均極顯著，在試驗值范圍內(nèi)隨著其濃度的提高，SCP產(chǎn)量均表現(xiàn)出極顯著的上升趨勢。因此，用DPS軟件優(yōu)化的熱帶假絲酵母SG-1發(fā)酵培養(yǎng)基為所考察的4個因素均應(yīng)取最高水平值（+1.6818），即甜高粱秸稈汁 220 mL/L、葡萄糖 37.5 g/L、 蛋白胨 37.5 g/L、MgSO4·7H2O 3.75 g/L、KH2PO43.75 g/L。以該優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行熱帶假絲酵母SG-1搖瓶分批發(fā)酵的驗證試驗，最終的菌體濕重達到129.04 g/L，干重為34.20 g/L，SCP產(chǎn)量為15.38 g/L，比原始配方下SCP產(chǎn)量（10.77 g/L）提高了42.80%。

3 結(jié)論

在以二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法 （DPS軟件v7.05版）進行熱帶假絲酵母SG-1產(chǎn)SCP的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中甜高粱秸稈汁、葡萄糖與蛋白胨的用量對熱帶假絲酵母SG-1產(chǎn)SCP表現(xiàn)出極顯著的正效應(yīng)。因此，熱帶假絲酵母SG-1產(chǎn)SCP的較佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：甜高粱秸稈汁220 mL/L、葡萄糖37.5 g/L、蛋白胨37.5 g/L、MgSO4·7H2O 3.75 g/L、KH2PO43.75g/L。該發(fā)酵培養(yǎng)基配方下SCP產(chǎn)量達到15.38 g/L，比初始發(fā)酵培養(yǎng)基配方下的SCP產(chǎn)量（10.77 g/L）提高了42.80%。

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