王 勇，馮香梅，喬嶺梅，岳 丹

（1.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津300211；2.天津醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，天津300203；3.中國人民解放軍第二五四醫(yī)院，天津300142）

在我國，近年隨著人均壽命的延長，膳食結構的改變和診斷技術的提高，前列腺癌（prostate cancer，PC）發(fā)病率有明顯增高的趨勢。肝細胞生長因子（hepatocytegrowth factor，HGF）是由間質細胞衍生的細胞因子，通過自分泌或旁分泌的形式作用于數(shù)種上皮源性細胞。通過作用于細胞膜表面的特異性跨膜受體c-MET蛋白發(fā)揮生物學作用，具有強促分裂、組織形成、誘導上皮細胞遷移、侵襲、誘導血管形成以及抑制細胞凋亡等作用[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)在胃癌、乳腺癌及肺癌等惡性腫瘤患者的腫瘤組織及血漿中HGF的濃度與腫瘤的進展相關[2-5]。本實驗擬觀察前列腺癌患者組織標本及血漿中HGF表達情況，為前列腺癌的診治提供新的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院2011年手術或穿刺活檢的前列腺癌38例和良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）組織標本 30例。病人年齡58～82歲?；颊咄ㄟ^術后或穿刺活檢標本病理確診為前列腺癌，通過肛診、骨掃描、CT、MRI及彩超來輔助進行前列腺癌的臨床分期。前列腺癌病理類型為前列腺腺癌；良性前列腺增生作為對照。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器 兔抗人HGF多克隆抗體（Abcam），β-actin抗體（Santa Cruz），SP染色試劑盒（福州邁新生物），HGF（h）ELISA試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德），RM2135組織切片機（LEICA），光學顯微鏡（OLYMPUS），酶標儀 550（Bio-Rad）。

1.2.2 免疫組化 采用鏈霉素抗生物素蛋白氧化物酶免疫組化法（streptavidin-peroxidase conjugated method，SP法），標本石蠟切片，HGF一抗4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）代替一抗作為陰性對照。根據(jù)各標記物的反應強度按陽性細胞所占細胞數(shù)量百分比與陽性細胞的染色強度進行評分。兩者分值相加最后得分：0～3分為陰性（-），3.5～6分為陽性（+），6.5～8分為強陽性（++）。見表 1。

表1 免疫組化評分標準Tab1 Thestandard of immunohistochem istry score

1.2.3 ELISA 按照說明書配制檢測所需的標準品及工作液，加入標準品及待測血清，反應后棄去板內液體，加入生物素抗人HGF抗體工作液，37℃反應60min，反復洗滌后加入親和素-過氧化物酶復合物（avidin-peroxidase complex，ABC）工作液，反應后再次洗滌，先后加入TMB顯色液及終止液，使用酶標儀在450 nm測定OD值，建立曲線，計算HGF濃度。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，具體分析統(tǒng)計方法見結果，以P<0.05為判斷差異顯著性標準。

2 結果

2.1 前列腺癌及前列腺增生組織中HGF的表達 前列腺增生及前列腺癌組織中HGF染色集中在間質的成纖維細胞及其周圍，癌細胞中少量表達（圖1）。前列腺增生及前列腺癌組織中HGF表達陽性率分別為43.33%（30例有13例表達）及78.95%（38例有30例表達），統(tǒng)計分析顯示二者之間差異具有高度顯著性（P<0.01）。HGF的表達與前列腺癌Gleason評分及T分期有關，Gleason評分大于7的癌組織中HGF表達高于Gleason評分小于7的癌組織（P<0.05）；與T1/T2期腫瘤相比較，T3/T4期腫瘤中HGF表達增高，差異具有顯著性（P<0.05）；本實驗中PSA≤10 ng/mL與＞10 ng/mL的患者之間及年齡≤70歲與＞70歲的前列腺癌患者之間相比較，癌組織中HGF表達差異無顯著性（P>0.05），見表2。

表2 前列腺癌組織中HGF的表達與各項臨床參數(shù)的關系Tab2 Comparison ofHGF exp ression in the tissuesaccording to different patient characteristic

2.2 前列腺癌及前列腺增生患者血漿中HGF濃度 前列腺癌患者血漿中HGF濃度明顯高于前列腺增生患者血漿中HGF濃度，二者比較差異具有高度顯著性（P<0.01）；與HGF在組織中表達相對應，患者血漿中的HGF濃度與前列腺癌Gleason評分及臨床分期有關；Gleason評分＞7及Gleason評分≤7的患者血漿中HGF濃度比較差異有顯著性（P<0.05）；與腫瘤局限于前列腺內的患者相比，腫瘤突破包膜的患者血漿中HGF水平升高，差異有顯著性（P<0.05）；前列腺癌患者的PSA水平及年齡不影響血漿中HGF的水平，見表3。

表3 前列腺癌患者血漿中HGF濃度與各項臨床參數(shù)的關系Tab3 Comparison of HGF level in the serum according to different patient characteristic

2.3 HGF在前列腺癌組織及血漿表達的相關性分析 應用Spearman秩相關分析證實HGF在前列腺癌組織及血漿表達呈正相關（rs=0.49，P=0.025）。

3 討論

本研究通過對前列腺增生及前列腺癌患者組織及血漿中的HGF表達進行檢測發(fā)現(xiàn)：前列腺癌患者癌組織及血漿中HGF表達明顯高于前列腺增生患者，HGF表達與前列腺癌臨床分期和Gleason評分相關。

前列腺癌是一種極易發(fā)生侵襲和轉移的男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤。我國前列腺癌的發(fā)病率雖明顯低于歐美國家，但近年來有增高的趨勢。前列腺癌發(fā)病隱匿，很多患者就診時即有淋巴結或骨轉移，前列腺癌根治術后患者腫瘤的復發(fā)及轉移，治療過程中進展為激素非依賴性前列腺癌，這都是目前前列腺癌的治療效果較差的原因。因此明確前列腺癌發(fā)生及進展的機制，尋找新的診斷及治療靶點成為當務之急。

HGF是由間質細胞衍生的細胞因子，通過自分泌或旁分泌的形式作用于數(shù)種上皮源性細胞，包括腫瘤細胞。通過作用于細胞膜表面的特異性跨膜受體c-MET蛋白發(fā)揮生物學作用，具有強促分裂、組織形成、誘導上皮細胞遷移、侵襲、誘導血管形成以及抑制細胞凋亡等作用[1]。與前列腺增生患者相比，前列腺癌患者血液中HGF濃度升高，腫瘤發(fā)生淋巴結轉移或者術后復發(fā)后，患者血液中HGF會進一步增高[6-7]。本研究同時對前列腺癌患者癌組織及血漿中HGF進行檢測發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者癌組織及血漿中HGF明顯高于前列腺增生患者，且與前列腺癌臨床分期和Gleason評分相關，進一步研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織及血漿中HGF的表達呈正相關，因此我們認為組織及血漿中的HGF可能成為前列腺癌篩查及預測腫瘤轉移的重要標志物。

Tsuka[8]研究組認為前列腺癌可能通過自分泌和旁分泌的形式來調節(jié)HGF的合成，這是前列腺癌患者血漿中HGF升高的重要原因。體外實驗證實前列腺癌可以通過旁分泌的方式分泌一些因子來刺激間質的成纖維細胞分泌HGF，但是前列腺癌中HGF合成的自分泌調節(jié)機制尚不清楚。Nakashiro[9-10]研究組發(fā)現(xiàn)前列腺基質細胞分泌HGF，作為旁分泌生長因子刺激激素非依賴性前列腺癌細胞生長，促進激素依賴性前列腺癌發(fā)生表型轉換。本研究中免疫組化結果發(fā)現(xiàn)HGF染色主要位于前列腺癌間質的成纖維細胞漿中及其周圍，癌細胞中只有少量表達，因此認為前列腺癌中HGF主要由間質細胞分泌，而后可能作用于癌細胞，發(fā)揮其生物學作用。我們在既往的研究中也發(fā)現(xiàn)NK4可以抑制HGF誘導的c-Met及其下游的ERK和Akt1/2蛋白的活化，從而調節(jié)腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[11]。HGF/c-Met可以作為前列腺癌治療的一個潛在的靶點。

總之，本實驗證實前列腺癌患者HGF表達明顯高于前列腺增生患者，且與前列腺癌臨床分期和Gleason評分相關，HGF可能是前列腺癌診療的潛在的靶點。

[1]Matsumoto K,Nakamura T.NK4 gene therapy targeting HGF-Met and angiogenesis[J].FrontBiosci,2008,13:1943

[2]Han SU,Lee JH,Kim W H,etal.Significant correlation between serum level of hepatocyte growth factor and progression of gastric carcinoma[J].World JSurg,1999,23（11）:1176

[3]UjiieH,TomidaM,Akiyama H,etal.Serum hepatocytegrowth factorand interleukin-6 areeffective prognosticmarkers for non-small cell lung cancer[J].Anticancer Res,2012,32（8）:3251

[4]Ahmed H H,Metwally F M,Mahdy E S,etal.Clinical value of serum hepatocyte growth factor,B-cell lymphoma-2 and nitric ox ide in primarybreastcancer patients[J].EurRevMed PharmacolSci,2012,16（7）:958

[5]Jung K H,Park BH,Hong SS.Progress in cancer therapy targeting c-Metsignalingpathway[J].Arch Pharm Res,2012,35（4）:595

[6]Gupta A,Karakiewicz P I,Roehrborn CG,etal.Predictive value of plasmahepatocytegrowth factor/scatter factor levels in patientswith clinically localized prostate cancer[J].Clin Cancer Res,2008,14（22）:7385

[7]Yasuda K,Nagakawa O,Akashi T,etal.Serum active hepatocyte growth factor（AHGF）in benign prostatic diseaseand prostate cancer[J].Prostate,2009,69（4）:346

[8]Tsuka H,MoriM H,Li B,etal.Enhanced hepatocytegrowth factor levelin human prostate cancer treated with endocrine therapy[J].Int JOncol,1998,13（1）:169

[9]Nakashiro K,Hara S,Shinohara Y,etal.Phenotypic switch from paracrine to autocrine role of hepatocyte growth factor in an androgen-independenthuman prostatic carcinoma cell line,CWR22R[J].Am JPathol,2004,165（2）:533

[10]Nakashiro K,OkamotoM,HayashiY,etal.Hepatocytegrowth factor secreted by prostate-derived stromal cells stimulates growth of androgen-inde pendenthu manprostatic carcinomacells[J].Am JPathol,2000,157（3）:795

[11]Yue D,Wang Y,Ma P,etal.Effects of transferred NK4 gene on proliferation,migration,invasion and apoptosis of human prostate cancer DU145 cells[J].Asian JAndrol,2010,12（3）:381