王 倩 ，馬躍美 ，孫 濤 ，劉艷榮 ，房東亮 ，田 原

（天津醫(yī)科大學(xué)1.外科手術(shù)學(xué)教研室；2.病理學(xué)教研室，天津300070）

白細(xì)胞介素-17（IL-17）在炎癥和自身免疫性疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用且在多種腫瘤中高表達(dá)，但其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用目前尚未定論。目前關(guān)于IL-17對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖作用的影響研究較少。近年來(lái)研究證明IL-17可以上調(diào)MMPs、IL-6和IL-8等促侵襲因子的表達(dá)促進(jìn)腫瘤侵襲[1-2]。黑色素瘤是一種高侵襲性的惡性腫瘤，腫瘤細(xì)胞本身可以分泌MMP-2和MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。本研究在前期研究慢性炎癥與腫瘤關(guān)系的基礎(chǔ)上，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討了IL-17對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞增殖和侵襲的影響，為進(jìn)一步研究IL-17在慢性炎癥與腫瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10由天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室凍存。重組鼠IL-17購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，transwell小室（直徑為 8μm）購(gòu)自Invitrogen公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10，接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中 (加入青霉素、鏈霉素各100 U/mL)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。所有實(shí)驗(yàn)均選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2 MTT法檢測(cè)B16細(xì)胞的增殖能力 將B16細(xì)胞制備成1×104/mL單細(xì)胞懸液，按每孔200μL接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后在培養(yǎng)液中加入終濃度分別為 5、10、20、50、100 ng/mL 的 IL-17，并設(shè)空白對(duì)照組，在培養(yǎng)箱中分別放置24、48、72 h后，加入MTT 100μL培養(yǎng)4 h，吸棄液體，每孔加入100μLDMSO充分溶解15min。用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)吸光度值(A值)，以5復(fù)孔的平均A值為相應(yīng)的A值。

1.2.3 transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)B16細(xì)胞的侵襲能力 用50mg/LMatrigel膠1∶8稀釋液包被transwell小室的上室面，37℃孵育過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，次日消化重懸細(xì)胞，于下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基、上室中加入無(wú)血清和濃度為50 ng/mL IL-17的B16細(xì)胞懸液各200μL，并設(shè)空白對(duì)照組，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出小室，PBS淋洗，擦去上室中細(xì)胞，95%酒精固定10min，4 g/L結(jié)晶紫染色，PBS清洗，200倍倒置顯微鏡下拍照穿膜細(xì)胞，隨機(jī)選10個(gè)視野，計(jì)算平均數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組各設(shè)3復(fù)孔。

1.2.4 明膠酶譜檢測(cè)B16細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)活性 將無(wú)血清的B16細(xì)胞接種到24孔板，每孔500μL，培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)液中加入50 ng/mL IL-17，培養(yǎng)48 h后，收集上清液，12 000 r/min，離心10min，取上清液進(jìn)行明膠酶譜檢測(cè)。以含0.1%明膠的10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳至溴酚蘭進(jìn)入陽(yáng)極緩沖液為止，分離凝膠，2.5%Triton-X100洗膠4次，每次30min。將膠完全浸入明膠酶孵育液（50mmol/L pH7.5Tris-HCl、10mmol/LCaCl2、200mol/LNaCl、1 μmol/L ZnCl2）中，37 ℃孵育 42 h，常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色至復(fù)染帶清晰，圖像分析系統(tǒng)測(cè)定凝膠中MMPs活性條帶活性水平，應(yīng)用Gel-pro analyzer分析軟件測(cè)定條帶平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS17.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析，多組比較采用方差分析，兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17對(duì)B16細(xì)胞增殖能力的影響 不同濃度IL-17作用于B16細(xì)胞24、48和72 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力無(wú)變化，IL-17對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.2 IL-17對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力的影響 50 ng/mL IL-17作用于B16細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表2 和圖 1）。

2.3 IL-17對(duì)B16細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)活性的影響 明膠酶譜檢測(cè)結(jié)果顯示，50 ng/mL IL-17作用于B16細(xì)胞48 h后，可明顯增強(qiáng)細(xì)胞MMP-2和MMP-9活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表3和圖 2）。

表1 IL-17作用不同時(shí)間B16細(xì)胞的A值(n=5)Tab1 Absorbanceof B16 cells treated with IL-17 on different time(n=5,)

表1 IL-17作用不同時(shí)間B16細(xì)胞的A值(n=5)Tab1 Absorbanceof B16 cells treated with IL-17 on different time(n=5,)

分組對(duì)照組5 ng/mL組10 ng/mL組20 ng/mL組50 ng/mL組100 ng/mL組FP 72 h 0.466±0.042 0.485±0.043 0.449±0.045 0.507±0.007 0.503±0.023 0.487±0.015 2.29 0.08 48 h 0.364±0.039 0.376±0.038 0.358±0.049 0.377±0.035 0.408±0.028 0.364±0.039 1.16 0.36 24 h 0.226±0.018 0.237±0.020 0.219±0.018 0.235±0.017 0.260±0.033 0.236±0.028 1.77 0.16

表2 IL-17對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力的影響)Tab2 Effectof IL-17 on invision ability of B16 cells

表2 IL-17對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力的影響)Tab2 Effectof IL-17 on invision ability of B16 cells

與對(duì)照組相比*P<0.01

n99組別對(duì)照組50 ng/mL組t穿膜細(xì)胞數(shù)8.89±1.45 34.22±1.56*35.61

表3 IL-17作用下B16細(xì)胞MMP-2和MMP-9的活性分析Tab3 AnalysisofMMP-2 and MMP-9 activitiesof B16 cells treated with IL-17

表3 IL-17作用下B16細(xì)胞MMP-2和MMP-9的活性分析Tab3 AnalysisofMMP-2 and MMP-9 activitiesof B16 cells treated with IL-17

與對(duì)照組相比*P<0.01，**P<0.001

MMP-9 5.26±0.29 28.28±1.51**26.00 MMP-2 7.06±0.62 13.64±2.32*4.75組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t

3 討論

IL-17是一種主要由活化記憶CD4+T細(xì)胞即Th17細(xì)胞分泌的促炎因子。研究表明，Th17細(xì)胞及IL-17與炎癥和自身免疫性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、多發(fā)性硬化等多種疾病相關(guān)。目前IL-17對(duì)腫瘤的作用尚存在爭(zhēng)論。有研究認(rèn)為，IL-17通過(guò)T細(xì)胞依賴的機(jī)制產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)[3]。但多數(shù)研究?jī)A向于IL-17的促腫瘤作用。IL-17通過(guò)激活I(lǐng)L-6依賴的Stat3信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[4]；IL-17可促進(jìn)人促絨癌JEG-3細(xì)胞的增殖和侵襲，但其機(jī)制尚未闡明[5]；結(jié)腸癌中，IL-17通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞分泌VEGF促進(jìn)腫瘤血管生成，且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[6]。

本課題組在前期建立小鼠氣囊卡介苗慢性炎癥模型[7]的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了氣囊卡介苗-黑色素瘤的慢性炎癥-腫瘤復(fù)合模型，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積、重量、明膠酶表達(dá)活性、微血管密度（MVD）及VEGF 5項(xiàng)指標(biāo)與生理鹽水-黑色素瘤對(duì)照組相比均升高。進(jìn)一步檢測(cè)小鼠血清細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，IL-17較其他細(xì)胞因子明顯升高，筆者推測(cè)在此氣囊卡介苗-黑色素瘤模型中IL-17可能對(duì)上述5項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。為了進(jìn)一步探討IL-17是否對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有直接作用，筆者在體外用IL-17刺激B16細(xì)胞，結(jié)果顯示IL-17并不直接刺激黑色素瘤細(xì)胞增殖，推測(cè)其可能通過(guò)誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞分泌VEGF進(jìn)而促進(jìn)血管生成來(lái)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

本研究transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-17處理后B16細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多，提示IL-17可以促進(jìn)B16細(xì)胞的體外侵襲。MMPs是一類與腫瘤侵襲相關(guān)的鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶家族，通過(guò)降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），破壞基底膜，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，其生成和活化依賴多種細(xì)胞因子。近年來(lái)研究表明MMPs的表達(dá)與IL-17相關(guān)。在銀屑病性關(guān)節(jié)炎中，IL-17可誘導(dǎo)IL-6、IL-8和MMP-3的產(chǎn)生，阻斷IL-17RA抑制它們產(chǎn)生[8]；在垂體腺瘤中研究發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)組腫瘤組織IL-17及IL-17R表達(dá)水平明顯升高且與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)[9]；而且IL-17通過(guò)激活A(yù)KT依賴的IL-6/JAK2/STAT 3信號(hào)途徑上調(diào)肝癌細(xì)胞IL-8、MMP-2、VEGF的表達(dá)，促進(jìn)肝癌遷移、侵襲[2]。本研究顯示，IL-17處理B16細(xì)胞后其MMP-2和MMP-9的活性增強(qiáng)，提示IL-17可能通過(guò)上調(diào)MMP-2和MMP-9的活性來(lái)促進(jìn)B16細(xì)胞的侵襲能力，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，IL-17對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖無(wú)明顯的刺激作用，但可增強(qiáng)細(xì)胞的體外侵襲能力，可能通過(guò)增強(qiáng)MMP-2和MMP-9的活性而發(fā)揮作用，其具體機(jī)制目前尚不清楚。本研究為探討IL-17在慢性炎癥與腫瘤進(jìn)展中的調(diào)節(jié)作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為通過(guò)調(diào)控IL-17等炎癥因子的方法抑制黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了新思路。

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