葉茂茂，李慧吉，武 成，潘從清，姜 睿

(1.北京市中關(guān)村醫(yī)院，北京 100190;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;3.天津中醫(yī)研究院，天津 300120;4.天津代謝病醫(yī)院，天津 300070;5.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150)

應(yīng)激是身體受到強(qiáng)烈刺激和處于緊張狀態(tài)時(shí)出現(xiàn)的一系列非特異性的全身反應(yīng)。心身醫(yī)學(xué)的研究中，應(yīng)激是一個(gè)基本因素，引起應(yīng)激的刺激叫應(yīng)激原，有多種分類，比如心理性、軀體性，而平時(shí)所指心身疾病應(yīng)激多指心理應(yīng)激。在實(shí)驗(yàn)研究中，動(dòng)物應(yīng)激的操作而多趨于軀體應(yīng)激，心理應(yīng)激因動(dòng)物與人類心理狀態(tài)不同而涉及少、難度大。本動(dòng)物模型制作為動(dòng)物糖尿病狀態(tài)下心理應(yīng)激模型的制作進(jìn)行探討，為糖尿病的后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康雄性wistar大鼠78只，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～200g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼以全價(jià)動(dòng)物飼料，自由飲水，動(dòng)物室內(nèi)自然光照，通風(fēng)良好，室溫保持在24℃，無(wú)其他不良刺激。

按體重隨機(jī)分為正常組23只，糖尿病組55只。

糖尿病模型制作過(guò)程中，糖尿病組死亡10只，篩除血糖不符合標(biāo)準(zhǔn)的15只。

隨后，進(jìn)行應(yīng)激實(shí)驗(yàn)時(shí)，正常組按體重、糖尿病組按血糖隨機(jī)分為以下幾組。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素(STZ)美國(guó)Sigma公司出品，批號(hào)S-0130;優(yōu)利特尿糖試紙;ONE TOUCHⅡ型血糖儀，血糖試紙美國(guó)雅培制藥有限公司;參照嚴(yán)氏等［1］的方法自制光電刺激實(shí)驗(yàn)箱:塑料實(shí)驗(yàn)盒外徑22×6×8cm，壁厚0.3cm，盒內(nèi)前部裝一個(gè)氖泡，氖泡下方安裝一個(gè)反光鏡，共20個(gè)連在一起，為自動(dòng)控制的電源箱。

1.3 模型制作

1.3.1 糖尿病造模方法 參考文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)性肥胖及糖尿病大鼠模型制作方法［2］制作模型，糖尿病組大鼠一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ，溶解于0.1mol/l的檸檬酸鈉緩沖液中，pH值4.0)，30mg/kg;正常組大鼠注射0.1mol/l的檸檬酸鈉緩沖液，30mg/kg，正常飲食。

2周后，糖尿病組飼料由全價(jià)動(dòng)物飼料改為自制高脂飼料，配方為碳水化合物50%，脂類25%，蛋白質(zhì)17%，麩皮7%，鹽0.5%，酵母粉0.5%［3.4］。3周后追加注射1次，方法同前。再5周后測(cè)糖尿病大鼠血糖，參考文獻(xiàn)以血糖高于16.7mmol/l為標(biāo)準(zhǔn)，納入實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 應(yīng)激方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自然光照，自由飲食，實(shí)驗(yàn)室隔間與飼養(yǎng)間隔音，光電刺激在每天上午8∶00～10∶00進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)分兩期順序進(jìn)行:Ⅰ期(第1～7天):此期間實(shí)施應(yīng)激組的大鼠每天每只分別在實(shí)驗(yàn)盒內(nèi)待25min，一般大鼠都能自行鉆入籠中，不鉆者剔除。無(wú)不自行鉆入籠中大鼠;Ⅱ期(第8～22天):對(duì)應(yīng)激組大鼠實(shí)施光電刺激，對(duì)N+應(yīng)激組、STZ+應(yīng)激組給予不規(guī)則光照+不規(guī)則電擊，每天每只老鼠分別在實(shí)驗(yàn)盒內(nèi)待25min。不規(guī)則電擊指電擊的頻率、時(shí)間隨機(jī)。第22天動(dòng)物禁食，只給予光照不給電擊，實(shí)驗(yàn)后立即做情緒喚醒行為學(xué)觀察，并取血測(cè)血糖。

給光、電刺激的參數(shù):(1)光:氖炮亮?xí)r光強(qiáng)度35lux，持續(xù)0.2s，滅時(shí)實(shí)驗(yàn)盒內(nèi)光強(qiáng)度約為 2Lux。(2)電刺激參數(shù):波寬 2mS，頻率 250Hz，串長(zhǎng) 1s，電流分別為 0.5mA、1.0mA、3.0mA、6.0Ma。

1.4 觀察內(nèi)容及方法

1.4.1 血糖檢測(cè) 用 ONE TOUCHⅡ型血糖儀和血糖試紙(美國(guó)雅培制藥有限公司)取大鼠尾靜脈血檢測(cè)各組大鼠血糖，測(cè)定時(shí)間固定于8∶00～10∶00內(nèi)進(jìn)行，測(cè)試前各組動(dòng)物禁食12h。

于應(yīng)激實(shí)驗(yàn)第22天應(yīng)激后，立即乙醚麻醉大鼠，球后靜脈叢取血，離心分離取血清，葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖。(試劑盒由海科銳生物技術(shù)中心提供，天津代謝病醫(yī)院代檢測(cè))

1.4.2 一般狀態(tài)觀察 包括大鼠反應(yīng)性、毛色、狀態(tài)、二便及飲食、體質(zhì)量情況。

1.4.3 情緒喚醒實(shí)驗(yàn) 情緒喚醒(Emotionality，指在開(kāi)放條件下動(dòng)物情緒始發(fā)性程度;動(dòng)物對(duì)一定刺激在行為上產(chǎn)生由遺傳決定的非特異性情緒性反應(yīng))水平測(cè)定，評(píng)估動(dòng)物自發(fā)的情緒興奮程度［5］。對(duì)大鼠掙扎程度、發(fā)聲程度及自發(fā)性排尿和排便情況進(jìn)行記錄。

具體做法如下:抓住鼠尾，將鼠取出籠、離地，力度以大鼠不掉下為準(zhǔn)，然后觀察30s，以評(píng)定掙扎程度、發(fā)聲、排尿、排便。

(1)掙扎程度以大鼠四肢不動(dòng)或輕微掙扎記0分，四肢掙扎、背部彎曲、頭朝上但未達(dá)尾部記1分，劇烈掙扎、翻身至尾部記2分;(2)發(fā)聲程度以大鼠被抓后無(wú)叫聲或1～4次嘰嘰叫，間隔時(shí)間長(zhǎng)記0分，5～10次尖叫記1分，≥10次尖叫急促記2分;(3)自發(fā)性排尿以無(wú)排尿者記0分，有排尿者記1分;(4)自發(fā)性排便以無(wú)排便者記0分，有排便者記1分。

將5項(xiàng)得分相加得出大鼠情緒喚醒水平每只大鼠僅作一次行為測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，采用SPSS 11.5版本統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)方法采用多組間單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血糖情況比較

表1 大鼠第10周血糖、體質(zhì)量比較(珋x±s)

糖尿病組大鼠血糖明顯高于正常組(P＜0.01)，且高于16.7mmol/l大鼠糖尿病血糖標(biāo)準(zhǔn)，糖尿病模型成功。應(yīng)激實(shí)驗(yàn)后各組血糖的檢測(cè)結(jié)果如下:STZ+應(yīng)激相對(duì)N+應(yīng)激組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相對(duì)STZ組有差異。

2.2 大鼠一般狀態(tài)觀察(表3)

2.3 大鼠情緒喚醒實(shí)驗(yàn)(表4)

表4顯示，由情緒喚醒實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，N+應(yīng)激組相對(duì)正常組大鼠反應(yīng)性相對(duì)要低，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。STZ+應(yīng)激組相對(duì)STZ組、N+應(yīng)激組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其反應(yīng)性明顯降低，說(shuō)明在糖尿病狀態(tài)，應(yīng)激對(duì)大鼠反應(yīng)性的影響比正常狀態(tài)要明顯，應(yīng)激更加降低了大鼠反應(yīng)性。

表2 糖尿病模型制作結(jié)果

表3 大鼠一般狀態(tài)變化

表4 各組大鼠情緒喚醒行為測(cè)定結(jié)果(珋x±s)

3 結(jié)論及分析

從應(yīng)激實(shí)驗(yàn)研究看，可以分為軀體應(yīng)激和心理應(yīng)激。研究方法包括束縛與制動(dòng)、條件反射性電擊、社會(huì)剝奪(如隔離飼養(yǎng))、母性行為應(yīng)激(妊娠、哺乳、疼痛)、心理應(yīng)激(擁擠、剝奪控制權(quán))和條件性恐懼等［6］，多少還帶有軀體應(yīng)激的成分。本實(shí)驗(yàn)采用光電結(jié)合應(yīng)激法，光和電的應(yīng)激時(shí)間、頻率、電的強(qiáng)度都是隨機(jī)的，兩者的搭配也是隨機(jī)的，并且最后1d只光照不電擊。由于前一段時(shí)間應(yīng)激為光電結(jié)合，使大鼠對(duì)光產(chǎn)生一種和電擊聯(lián)系起來(lái)的恐怖心理。從心理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究看，最后應(yīng)激是無(wú)軀體應(yīng)激(電擊)的，但只給予光照時(shí)，也可以對(duì)大鼠產(chǎn)生應(yīng)激，所以認(rèn)為這種實(shí)驗(yàn)應(yīng)激方法是區(qū)別于軀體應(yīng)激的心理應(yīng)激［7］。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看到，糖尿病應(yīng)激組相對(duì)糖尿病組的反應(yīng)性有明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明應(yīng)激對(duì)糖尿病大鼠的影響比正常大鼠要大，應(yīng)激更加抑止了糖尿病大鼠的反應(yīng)性。糖尿病應(yīng)激組的血糖相對(duì)糖尿病組有升高趨勢(shì)，應(yīng)激對(duì)其也產(chǎn)生了影響。臨床觀察，糖尿病是心身疾病，其本身的發(fā)病、發(fā)展都受心理因素的影響，與實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以相參照。進(jìn)一步推測(cè)對(duì)相同的心理應(yīng)激事件，糖尿病病人相對(duì)正常人承受能力要差，而造成糖尿病病情發(fā)展［8］。

中醫(yī)的情志學(xué)說(shuō)包括七情、五志、五神等內(nèi)容，它體現(xiàn)了現(xiàn)代心理學(xué)的基本心理過(guò)程。情志學(xué)說(shuō)與應(yīng)激理論都認(rèn)為，人體在受到外界刺激時(shí)會(huì)有相應(yīng)的反應(yīng)，而在過(guò)量、過(guò)久的應(yīng)激下會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生。中醫(yī)情志學(xué)重視主觀體驗(yàn)和“形神合一”，應(yīng)激理論側(cè)重心理-身體的反應(yīng)。兩者思維相似，認(rèn)為“心”“身”相關(guān)?？梢?jiàn)，中醫(yī)情志學(xué)與西方應(yīng)激理論從認(rèn)識(shí)方法和致病因素上都有很多相通之處。中醫(yī)證候動(dòng)物模型是根據(jù)中醫(yī)病因病機(jī)理論，利用特定的致病因素，在動(dòng)物身上復(fù)制出與人體疾病癥狀和病理改變相近或相似的證候。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)中醫(yī)情志學(xué)病因病機(jī)理論，用無(wú)規(guī)律的不良情志刺激影響了糖尿病大鼠的病理狀態(tài)，既有血糖升高的糖尿病“病”的特征，又有精神萎靡、活動(dòng)遲緩、毛發(fā)灰暗及行為學(xué)改變等類似人體的“氣機(jī)失調(diào)證”的外在表現(xiàn)，基本符合病證結(jié)合模型。

本實(shí)驗(yàn)先用小劑量的STZ注射再加高脂飲食的方法制作糖尿病模型，在此基礎(chǔ)上，用光電應(yīng)激方法模擬了心理應(yīng)激，依據(jù)中醫(yī)情志學(xué)說(shuō)，制作了病(糖尿病)證(氣機(jī)失調(diào)證)結(jié)合的大鼠模型，為心身疾病糖尿病的進(jìn)一步后續(xù)研究打下了動(dòng)物模型基礎(chǔ)，并為心理應(yīng)激實(shí)驗(yàn)提供了參考。

［1］ 嚴(yán)進(jìn)，王春安，葉阿莉，等.軀體性和心理性應(yīng)激對(duì)大鼠血漿皮質(zhì)酮變化的影響［J］.心理學(xué)報(bào)，1991，4:418-424.

［2］ 謝明智，劉海帆，張凌云，等.實(shí)驗(yàn)性肥胖及糖尿病大鼠模型［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1985，20(11):801-8062.

［3］ 袁錦虹，劉志誠(chéng)，趙玫.針刺對(duì)實(shí)驗(yàn)性非胰島素依賴性糖尿病大鼠下丘腦視上核中樞的影響［J］.浙江中醫(yī)雜志，2000，11:498.

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［5］ 吳大興，姚樹(shù)橋，戴曉陽(yáng)，等.中國(guó)地鼠情緒喚醒水平評(píng)定量表的制定［J］.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，24(5):403-406.

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［7］ 嚴(yán)進(jìn)，王春安，陳宜張.心理應(yīng)激引起的大鼠行為、血漿皮質(zhì)酮及腦區(qū)氨基酸水平的變化［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，18(4):330-333.

［8］ 葉茂茂，李慧吉，武成，等.心理應(yīng)激對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠行為、血糖的影響及復(fù)方中藥的干預(yù)作用［J］.江蘇中醫(yī)藥，2007，39(9):70-72.