趙宏艷，王 燕，于 崢，劉梅潔，劉 紅，李 艷，呂 誠，譚 勇，肖 誠，鞠大宏△

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;2.民航總醫(yī)院病理科，北京 100123;3.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700;4.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029)

辨證論治是中醫(yī)藥治病的優(yōu)勢所在，建立切實符合疾病發(fā)病內(nèi)在本質(zhì)的動物模型的制作方法，對中醫(yī)學(xué)的發(fā)展具有重要意義。我們課題組對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)腎虛證及脾虛證大鼠模型開展了大量研究［1，2］。本實驗在此基礎(chǔ)上觀察益腎蠲痹丸對這兩種證型RA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度及血漿免疫因子的影響，以期從基礎(chǔ)研究方面對辨證論治有進(jìn)一步的闡述。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用6周齡SPF級SD大鼠114只，由中國藥品生物制品檢定所提供(動物許可證號SCXK(京)2005-0004)，在中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級動物室喂養(yǎng)(實驗動物室許可證號SYXK(京)2005-0024)。

1.1.2 主要試劑與儀器 (1)主要試劑:牛Ⅱ型膠原(貨號20022，批號100028)、不完全弗氏佐劑(貨號 7002，批號 100106):美國 Chondrex公司產(chǎn)品;戊巴比妥鈉(批號020427):北京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;大鼠白細(xì)胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒(貨號 BMS625，批號 49542016)、大鼠白細(xì)胞介素(IL)-10 ELISA試劑盒(貨號 BMS629，批號49611006)、大鼠干擾素(IFN)-γELISA試劑盒(貨號BMS621，批號 48768013):美國 Bender公司產(chǎn)品;利血平針劑:廣東邦民制藥廠;羥基脲(批號810025LC):齊魯制藥有限公司;益腎蠲痹丸:江蘇正大清江制藥有限公司;(2)主要儀器:T10 BASIC手持式分散機(jī):德國IKA公司產(chǎn)品;Multiskan Mk3酶標(biāo)儀、Wellwash 4 Mk2洗板機(jī):美國Thermo公司;K15離心機(jī):德國 Sigma公司產(chǎn)品;足趾容積測量儀:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為以下10組:正常對照組10只，假手術(shù)組10只，CIA組12只，CIA治療組12只，腎虛證(去勢法)CIA組11只，腎虛證(去勢法)CIA組治療組11只，腎虛證(羥基脲法)CIA組12只，腎虛證(羥基脲法)CIA治療組12只，脾虛證(利血平法)CIA組12只，脾虛證(利血平法)CIA治療組12只。

CIA 組、CIA 治療組:按前期方法進(jìn)行［1，2］。去勢CIA組、去勢 CIA組治療組:按常規(guī)方法［3］做去勢手術(shù)，即摘除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組大鼠只摘除雙側(cè)卵巢附近的脂肪組織;術(shù)后28 d，去勢 CIA組再按前期方法進(jìn)行CIA模型復(fù)制。羥基脲CIA組、羥基脲 CIA治療組:大鼠給予羥基脲(375 mg·kg－1·d－1)灌胃，灌胃17 d后按前期方法進(jìn)行CIA模型復(fù)制。利血平 CIA組、利血平 CIA治療組:大鼠給予利血平(0.5 mg·kg－1·d－1)腹腔注射［4］，14 d 后按前期方法進(jìn)行CIA模型復(fù)制。

為保證免疫條件的齊同性，各組均在同一時間免疫。即以免疫時間為基準(zhǔn)點，在免疫前28 d行去勢手術(shù)、免疫前17 d灌服羥基脲、免疫前14 d腹腔注射利血平。II型膠原免疫18 d后，從每組篩選出10只關(guān)節(jié)炎指數(shù)≥1分大鼠，即剔除未發(fā)病的大鼠開始給藥。各治療組均灌胃給予益腎蠲痹丸(3.67 g/kg·d)，每日1次，連續(xù)4周，其余各組灌以等容積生理鹽水。

1.2.2 取材 戊巴比妥鈉麻醉下，采用腹主動脈取血，2500 r/min，20 min離心后取血漿，分裝后－80℃冰凍備用。

1.2.3 指標(biāo)的測定 (1)關(guān)節(jié)腫脹度的測量方法:致炎前在大鼠后肢踝關(guān)節(jié)上方0.5 cm處做出標(biāo)記，用足趾容積測量儀測量其容積，計算出其關(guān)節(jié)腫脹度:腫脹度(edema rate，ER)=(Vt-V0)/V0×100%，其中V0表示造模前的容積，Vt表示造模后的容積;(2)血漿 IL-6、IL-10、IFN-γ 的測定:按試劑盒說明操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出樣本中各因子的含量。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 益腎蠲痹丸對CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度的影響

與CIA組比較，去勢CIA組及羥基脲CIA組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度明顯升高(P＜0.05);利血平 CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度亦明顯升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與羥基脲CIA組比較，羥基脲CIA治療組關(guān)節(jié)腫脹度明顯下降(P＜0.05);與去勢 CIA組比較，去勢CIA治療組關(guān)節(jié)腫脹度亦明顯下降(P＜0.05);利血平CIA治療組與利血平CIA組比較，關(guān)節(jié)腫脹度明顯下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。

2.2 益腎蠲痹丸對CIA大鼠血漿IL-6含量的影響

與正常對照組比較，各CIA組及給藥組大鼠IL-6含量明顯升高(P＜0.01)。與 CIA組比較，去勢CIA組大鼠IL-6含量明顯升高(P＜0.01)，羥基脲CIA組和利血平CIA組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。給藥組與相應(yīng)模型組比較，去勢CIA和羥基脲CIA大鼠治療后IL-6含量明顯下降(P＜0.01，P＜0.05)。對照CIA及利血平CIA大鼠治療后，IL-6含量亦下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖2)。

2.3 益腎蠲痹丸對CIA大鼠血漿IL-10含量的影響

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度變化(珔x±s，n=10)注:與正常對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與 CIA組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01;與羥基脲 CIA組比較:5)P＜0.05，6)P＜0.01;與去勢 CIA 組比較:7)P＜0.05，8)P ＜0.01;與利血平CIA組比較:9)P＜0.05，10)P＜0.01(下同)

圖2 各組大鼠血漿 IL-6含量變化(珔x±s，n=10)

與正常對照組比較，各CIA模型組及給藥組IL-10含量明顯升高(P＜0.01)。與 CIA組比較，CIA治療組、去勢 CIA組、羥基脲 CIA組和利血平 CIA組IL-10含量明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。羥基脲CIA組大鼠和去勢 CIA組大鼠治療后，IL-10含量明顯升高(P＜0.01)，利血平 CIA治療組與利血平CIA組比較，IL-10含量無顯著性變化(見圖3)。

圖3 各組大鼠血漿 IL-10含量變化(珔x±s，n=10)

2.4 益腎蠲痹丸對 CIA大鼠血漿 IFN-γ含量的影響

與正常對照組比較，各 CIA模型組及給藥組INF-γ含量明顯升高(P＜0.01)。與 CIA組比較，去勢CIA組 INF-γ含量明顯升高(P＜0.01)，羥基脲CIA組和利血平CIA組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與去勢CIA組比較，去勢CIA治療組IFN-γ含量明顯下降(P＜0.01);與相應(yīng)模型組比較，CIA治療組、羥基脲CIA治療組、利血平CIA治療組IFN-γ含量明顯下降(P＜0.05)(見圖4)。

圖4 各組大鼠血漿INF-γ含量的變化(珔x±s，n=10)

3 討論

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹病”范疇，本病的病因病機(jī)是正氣虧虛，營衛(wèi)不和，邪氣乘虛而入，流注筋骨，搏結(jié)關(guān)節(jié)，而發(fā)為痹痛。中醫(yī)專家朱良春根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗，認(rèn)為本病病變在骨，骨為腎所主，故應(yīng)益腎壯督治其本，蠲痹通絡(luò)治其標(biāo)，從而研制出益腎蠲痹丸。益腎蠲痹丸是治療RA的國家三類新藥，由骨碎補(bǔ)、淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、當(dāng)歸、全蝎、土鱉蟲、僵蠶、蜈蚣、蜂房、烏梢蛇等中藥組成。方中熟地黃、淫羊藿、骨碎補(bǔ)等補(bǔ)肝腎而扶正氣;烏梢蛇、僵蠶、全蝎、蜂房等具有蠲痹通絡(luò)、搜剔病邪的作用，諸藥相合，而達(dá)到溫補(bǔ)腎陽、益腎壯督、搜風(fēng)剔邪、蠲痹通絡(luò)之功效［5］。因此選用該藥作為本實驗補(bǔ)腎除痹的代表藥物，從以方測證的角度觀察該藥對單純痹證、腎虛痹證及脾虛痹證的療效，從而為RA病證結(jié)合動物模型的制作提供更有力的評判依據(jù)。

我們課題組根據(jù)前期的研究，制備了腎虛證與脾虛證CIA大鼠模型。實驗結(jié)果表明，各證型CIA大鼠免疫后相繼出現(xiàn)踝關(guān)節(jié)腫脹、行動遲緩和跛行。益腎蠲痹丸可以顯著減輕腎虛證CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度，也可以減輕對照及脾虛證CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度，但療效明顯低于腎虛證CIA大鼠，說明中醫(yī)辨證治療的合理性。

研究表明，在RA病人的關(guān)節(jié)液和滑膜組織中陸續(xù)檢測出多種細(xì)胞因子，根據(jù)性質(zhì)的不同可以分為2大組，一組為促進(jìn)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，主要包括 IL-1、IFN-γ、IL-6、TNF-α 等;另一組為抑制炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，如 IL-10、IL-4、TGF等。這2組細(xì)胞因子之間相互抑制產(chǎn)生、作用互相對抗。IL-6是一種具有活化T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞等多種功能的細(xì)胞因子，是RA病理通路中起重要作用的細(xì)胞因子。RA滑膜中IL-6呈高表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)RA患者關(guān)節(jié)炎性滲出液中，在某些RA患者的血清中也可測得，并且IL-6的血清水平與C反應(yīng)蛋白、α1-酸糖蛋白、α1抗胰蛋白酶、纖維蛋白原、親血球蛋白以及疾病活動度和關(guān)節(jié)損傷相關(guān)等均有關(guān)［6］。在CIA模型中，不論是血清中還是在其骨髓中，內(nèi)生IL-6水平也是升高的，這反映了疾病嚴(yán)重程度的增加［7］。IFN-γ主要由活化的 T細(xì)胞和 NK細(xì)胞產(chǎn)生，主要作用有活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)MHCI、II類抗原的表達(dá)，增強(qiáng)NK活性，抑制纖維母細(xì)胞產(chǎn)生膠原，刺激并增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，在RA的發(fā)病機(jī)制中起著不容忽視的作用［7］。IL-10是一種具有很強(qiáng)免疫抑制及免疫調(diào)控作用的細(xì)胞因子。幾種不同的RA動物模型實驗證實，IL-10具有治療作用，能抑制CIA 模型的進(jìn)展，減輕關(guān)節(jié)腫脹和軟骨破壞［8，9］。

本實驗結(jié)果表明，CIA組與各證型CIA組大鼠IL-6和IFN-γ水平較正常組顯著升高，與以往的研究結(jié)果一致。與 CIA組比較，去勢 CIA組 IL-6和IFN-γ含量明顯升高，羥基脲 CIA組和利血平 CIA組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)給予益腎蠲痹丸后，大鼠血漿IL-6水平均有降低，其中去勢 CIA組明顯下降，CIA組、羥基脲CIA組和利血平CIA組雖含量下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義;大鼠血漿IFN-γ水平亦顯著降低，其中去勢CIA組顯著下降，羥基脲CIA組、利血平CIA組、CIA組含量亦明顯下降。實驗結(jié)果亦表明，CIA組大鼠及不同證型CIA組大鼠血漿中IL-10水平較正常組顯著升高，且不同證型CIA組大鼠血漿中IL-10水平與CIA組大鼠相比明顯升高。CIA大鼠及不同證型CIA大鼠血漿中IL-10水平的升高或可能為補(bǔ)償性增加，已有相似的研究報道［10］。經(jīng)益腎蠲痹丸后，各組CIA大鼠血漿IL-10水平均繼續(xù)升高，但不同證型CIA大鼠IL-10升高水平不同，以腎虛組IL-10水平升高最為明顯。

以上結(jié)果從血漿 IL-6、IFN-γ及 IL-10含量，反映了益腎蠲痹丸對各證型CIA大鼠異常的自身免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，益腎蠲痹丸可下調(diào)各證型 CIA大鼠血漿中 IL-6與 IFN-γ含量，上調(diào)IL-10含量，其中腎虛證 CIA大鼠的調(diào)節(jié)作用要優(yōu)于脾虛證CIA大鼠及CIA組大鼠，而去勢所致腎虛CIA大鼠的療效要略優(yōu)于羥基脲所致腎虛CIA大鼠，表明去勢法制作的腎虛證CIA模型更符合中醫(yī)的腎虛證候動物模型，同時也進(jìn)一步闡明了中醫(yī)辨證治療的合理性。

［1］ 王燕，趙宏艷，劉梅潔，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎腎虛證大鼠的建立［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2011，9(9):973-982.

［2］ 杜中平，趙宏艷，肖誠，等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎脾虛證病證結(jié)合動物模型的建立［J］.世界科學(xué)技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化)，2012，14(2):1384-1392.

［3］ 鞠大宏，于福祿，張麗坤，等.滋陰補(bǔ)腎法對卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞COX-2蛋白和mRNA表達(dá)的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006，14:44-46.

［4］ 趙寧，賈紅偉，張皖東，等.利血平所致脾虛大鼠脾陽虛證和脾氣虛證的證候?qū)傩裕跩］.中醫(yī)雜志，2008，49(5):449-452.

［5］ 張文康，朱良春.中國百年百名中醫(yī)臨床專家叢書［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2001:184-237.