富 蘇，韓經(jīng)丹，周 杰，范吉平△

(1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700;2.中國中醫(yī)科學院，北京 100700;3.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102)

近幾年，在各種腦缺血模型中均看到神經(jīng)元壞死伴有凋亡發(fā)生，并認為凋亡是缺血性神經(jīng)元死亡的一種形式。研究證實，缺血性腦損傷時的細胞死亡不僅存在壞死，而且會有大量細胞凋亡［1，2］。細胞凋亡成為腦缺血損傷中的研究熱點，并成為開發(fā)治療藥物的治療靶點。熊膽粉味苦性寒，歸肝、膽、心、胃經(jīng)，功用清熱解毒。導(dǎo)師范吉平教授依據(jù)多年中風病治療的臨床經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)熊膽粉對腦缺血損傷具有良好的保護作用，既往臨床試驗也證實以熊膽粉為君藥的通絡(luò)化痰膠囊可減少腦梗死病人的神經(jīng)功能缺損癥狀［3］。本研究將試圖探討熊膽粉對腦缺血損傷大鼠神經(jīng)行為學、腦組織病理學、神經(jīng)細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級SD雄性健康成年大鼠，體質(zhì)量320～350g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證號SCXK(京)2006-0009)。

1.2 藥物

熊膽粉:由山東沃華醫(yī)藥科技股份有限公司提供;陽性對照藥物尼莫地平(商品名:尼膜同):購于拜耳醫(yī)藥(國藥準字 H20003010，生產(chǎn)批號BJ03850)。

1.3 主要儀器和試劑

恒溫手術(shù)臺(SHOR-LINE);MCAO線栓(沙東線栓);電子分析天平(Sartorius);Narrow-Alley Corner Test實驗儀器(北京寬街醫(yī)院);石蠟包埋機(Leica，EG1150H);石蠟切片機(Leica，RM2255);正置顯微鏡(Olympus BX51);光學照像生物顯微鏡(Leica，DMLB-HC);圖像采集系統(tǒng)(Leica DM4000B);圖像分析系統(tǒng)(Image-pro Plus 5.0)。

水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司);0.9%生理鹽水(石家莊四藥);4%多聚甲醛(SUNBIO);超純水(中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心機能實驗室);乙醇、二甲苯、鹽酸酒精、伊紅(北京化工廠)蘇木精(北京化學試劑公司);TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德)。

1.4 造模方法

大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 mL·100 g－1)，大鼠麻醉成功后仰臥位固定，頸部正中切口，分離并暴露右側(cè)頸總動脈及頸內(nèi)、外動脈，頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈搭一根尼龍線系活扣，頸外動脈近心端和遠心端分別用一根尼龍線結(jié)扎，兩根結(jié)扎尼龍線之間間距0.5 cm。頸總動脈動脈夾加閉后，在頸外動脈上兩根結(jié)扎的尼龍線之間剪短，后將頸外動脈近心端下翻，與境內(nèi)動脈成一天直線，從頸外動脈減一個小口，插入線栓，插入長度約為(20.0±0.5)mm時感到有輕微阻力時停止，在頸內(nèi)動脈處扎緊尼龍線并固定線栓，并扎緊頸總動脈近心端尼龍線，取下動脈夾，縫合皮膚。術(shù)后常規(guī)護理。待實驗動物清醒后，進行Zea-Longa神經(jīng)功能評分，神經(jīng)功能評分標準為:a.無神經(jīng)功能損傷癥狀，動物正?；顒樱M食評0分;b.將動物尾巴提起后，左前肢屈曲1分;c.將動物放置平板上，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈2分;d.將動物放置平板上，用手輕推向左側(cè)傾倒3分;e.動物左側(cè)偏癱，不能自發(fā)行走意識朦朧或喪失4分。評分大于或等于2分，則表明模型成功，低于2分則予以去除。

1.3 分組和給藥

造模成功的實驗動物，根據(jù)神經(jīng)功能評分分層隨機分為5組，分別為正常對照組(蒸餾水)、假手術(shù)組(蒸餾水)、模型組(蒸餾水)、尼莫地平組(尼莫地平研碎蒸餾水溶解，按照臨床用量人大鼠體表面折算給藥劑量為32.4 mg·kg－1，配制成藥物濃度為3.24 mg·mL－1的蒸餾水溶液)、熊膽粉組(通絡(luò)化痰膠囊蒸餾水溶解，按照臨床用量人大鼠體表面折算給藥劑量為27 mg·kg－1，配制成藥物濃度為2.7 mg·mL－1的蒸餾水溶液)。從術(shù)后第1天開始給藥，以1 mL·100 g－1體重體積灌胃給藥，每天 1 次，連續(xù)灌胃給藥7d。

1.4 行為學測試

于術(shù) 后第 1、2、3、5、7 天進行 Narrow-Alley Corner Test行為學測試。Narrow-alley Corner Test是被國外學者廣泛使用的2種神經(jīng)行為學實驗，主要用以檢測大鼠“不對稱感覺運動功能障礙”(asymmetrical sensorimotor dysfunction)［4，5］。不對稱分值=(向右側(cè)作站立轉(zhuǎn)身的次數(shù)/總的站立轉(zhuǎn)身的次數(shù))×100%，正?；€為50%，分值越高，反映損傷越嚴重。

1.4 取材及標本制作

術(shù)后第8天每組隨機取6只，10%水合氯醛深度麻醉(0.35 mL·100 g－1)，迅速打開胸腔，暴露心臟，剪開右心房，于心尖部剪開左心室，插管至主動脈，快速注入100 ml生理鹽水沖洗后，再以體積分數(shù)為4%的多聚甲醛(PH值調(diào)成7.0左右)灌注固定后斷頭取腦。取得的腦組織入4℃4%多聚甲醛固定液中固定過夜，經(jīng)過固定、脫水、透明、石蠟包埋處理，連續(xù)冠狀切片，切片厚度為5μm。

1.5 HE染色和尼氏染色

上述標本行HE染色，光鏡下觀察缺血側(cè)腦缺血區(qū)及其周圍組織的病理學變化。

1.6 TUNEL法測細胞凋亡

組織切片，常規(guī)脫蠟，抗原修復(fù)后用 0.3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加TUNEL反應(yīng)混合溶液，37℃避光孵育60 min，滴加轉(zhuǎn)化劑，37℃孵育30 min，DAB顯色、脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察。陰性對照不加TDT。首先在40倍光鏡下定位缺血側(cè)缺血半暗帶額頂葉皮層，每組6只，每只動物取5張相同部位腦片，后在400倍光鏡下選取5個相鄰視野對陽性神經(jīng)元(胞漿呈棕黃色顆粒)進行觀察，采用 Image-pro Plus 5.0軟件計數(shù)陽性細胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(珋x±s)表示，采用SPSS軟件作統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 熊膽粉對pMCAO大鼠神經(jīng)行為學測試的影響

各組大鼠造模后缺血 1、2、3、5、7d Narrow Alley Corner Test評分結(jié)果見下表1。正常對照組和假手術(shù)組大鼠沒有神經(jīng)功能缺損癥狀，各缺血組大鼠神經(jīng)缺損癥狀表現(xiàn)明顯，與正常對照組和假手術(shù)組有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，但隨著缺血時間的延長而逐漸的自行恢復(fù)，而熊膽粉組和尼莫地平組大鼠神經(jīng)缺損癥狀的恢復(fù)速度快于模型組，與模型組有差異(P＜0.01，P ＜0.05)。

2.2 熊膽粉對pMCAO大鼠缺血側(cè)病理學改變的影響

正常對照組和假手術(shù)組神經(jīng)細胞排列有序，未見水腫，胞體、核仁、核仁清晰。模型組大鼠缺血側(cè)壞死區(qū)范圍明確，壞死區(qū)內(nèi)可見間質(zhì)內(nèi)大小不等的空泡，其間散在著神經(jīng)細胞;部分神經(jīng)細胞核固縮、深染，未見核仁;部分神經(jīng)細胞核溶解、胞漿疏松，細胞界限不清;大部分細胞有退形性變，神經(jīng)細胞內(nèi)病變較彌漫，可見深藍色、新月樣凋亡細胞。熊膽粉組和尼莫地平藥組大鼠腦組織可見壞死區(qū)減小，其周邊可見神經(jīng)細胞、胞漿、胞核尚能分清，可見細胞帶有中斷，有細胞脫失，結(jié)構(gòu)完整可辨的神經(jīng)元數(shù)量較多，變性壞死組織范圍相對較小、程度較輕。

Table 1-1 Effect of Bear bile power on the Nar row-Alley Corner Test of Rats with p MCAO(珋x±s)

Fig.1 Effect of Bear Bile Power Capsule on the morphological changes in the cerebral cor tex induced of rats with p MCAO(HE staining×400)A.normal group B.sham group C.model group D.nimodipine group E.BBP group

Fig.2 Effect of Bear Bile Power on the neuronapoptosis of ischemic penumbra of rats with p MCAO(TUNEL×400)A.normal group B.sham group C.model group D.nimodipine group E.BBP group

2.3 熊膽粉對pMCAO大鼠缺血半暗帶神經(jīng)細胞凋亡的影響(TUNEL法)

表2圖2顯示，正常對照組和假手術(shù)組未見明顯凋亡細胞。模型組大鼠缺血半暗帶皮層可見大量的凋亡細胞，與正常對照組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。凋亡細胞核被染成棕褐色，表現(xiàn)為細胞核固縮，胞體縮小變形、破裂成小碎片或出現(xiàn)凋亡小體。與模型組比較，尼莫地平和熊膽粉給藥干預(yù)后其凋亡細胞數(shù)顯著降低(P＜0.01)，具有明顯的抑制細胞凋亡的作用。

Table 2 Effect of Bear bile power on the neuron apoptosis ofischemic penumbra of rats with p MCAO(x珋±s)

4 討論

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡(programed cell death，PCD)，是由基因控制的細胞自主有序的死亡。MacManuS等在1993年首次報道大鼠全腦缺血與神經(jīng)細胞凋亡的關(guān)系，至此之后神經(jīng)細胞凋亡在腦缺血損傷中的作用日益受到關(guān)注。研究表明，神經(jīng)細胞凋亡是腦缺血損傷病理作用的重要環(huán)節(jié)，是造成腦缺血損傷后繼發(fā)性損害的重要機制［6，7］。腦缺血損傷既可造成細胞壞死，又可誘導(dǎo)細胞凋亡。細胞壞死是一個不可逆的過程，而細胞凋亡則是受一系列程序調(diào)控的過程，在腦缺血損傷后及早進行抗凋亡治療具有重要意義［8］。

熊膽粉味苦性寒，歸肝、膽、心、胃經(jīng)，功用清熱解毒。既往研究觀察注射用熊膽粉對腦血栓、腦缺血動物模型的影響，結(jié)果注射用熊膽粉可明顯抑制大鼠體內(nèi)外血栓的形成，降低血液黏度，改善血液流變性，抑制血小板聚集，降低血小板黏附性，改善血栓性缺血腦組織病變程度，降低毛細血管通透性，且可降低損傷腦組織中丙二醛(MDA)水平，保護超氧化物歧化酶(SOD)活性，注射用熊膽粉對腦缺血有保護和治療作用［9］。腦缺血損傷后的級聯(lián)反應(yīng)所形成的一系列神經(jīng)生化毒素，導(dǎo)致神經(jīng)功能損害，當屬中醫(yī)學痰、瘀、毒邪范疇，亦為應(yīng)用中藥抑制或阻斷缺血后級聯(lián)反應(yīng)成為中醫(yī)藥治療中風病的特色機制。本研究揭示，腦缺血損傷后早期應(yīng)用熊膽粉對神經(jīng)功能障礙的恢復(fù)、腦組織病理學改變有著一定的作用，其機制可能與熊膽粉可挽救缺血半暗帶神經(jīng)細胞凋亡有著一定的關(guān)系，然而熊膽粉減少缺血半暗帶皮層神經(jīng)元凋亡的機制還有待于研究進一步揭示。

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