尚曉玲，樸松蘭，呂野夫

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)由T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性自身免疫性脫髓鞘疾病(experimental allergic encephalomyelities，EAE)，其復(fù)發(fā)率和病殘率較高。臨床實(shí)踐表明，以益腎解毒通絡(luò)法為主的中藥復(fù)方益腎達(dá)絡(luò)飲，在減輕MS臨床癥狀、減少復(fù)發(fā)方面具有較好的療效。為進(jìn)一步探討其治療機(jī)理，我們進(jìn)行了益腎達(dá)絡(luò)飲對(duì)EAE小鼠神經(jīng)損傷后的修復(fù)研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)8～12周齡的SJL/J雌性小鼠40只，體質(zhì)量18～20g，由美國 Jackson實(shí)驗(yàn)室提供，動(dòng)物飼養(yǎng)在吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SJL/J小鼠在實(shí)驗(yàn)前清潔飲水，自由飲食。

1.2 藥品與試劑

抗原 PLP139-151(HSLGKWLGHPDKF)多肽購自北京賽百盛生物工程公司，純度85%以上;百日咳桿菌購自北京生物制品研究所;完全福氏免疫佐劑購自美國Sigma公司;MCP-1免疫組化、原位雜交試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司;醋酸潑尼松購自天津天藥藥業(yè)有限股份(批號(hào)1006042)，經(jīng)研缽粉碎后以雙蒸水溶解，充分混勻，配成0.039%濃度，4℃保存，使用前混搖均勻;益腎達(dá)絡(luò)飲(由熟地、鹿角膠、梔子、石菖蒲、生甘草等組成)飲片購自長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，經(jīng)常規(guī)方法煎煮后制成2g生藥/mL的水提物，分裝滅菌后4℃保存?zhèn)溆?NgR、Gap-43免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物模型制備

用PLP139-151制作抗原免疫小鼠:將 100μL PLP139-151 水 溶 液 (含 PLP139-151 150μg)與100μL完全福氏免疫佐劑(含結(jié)核桿菌H37RA400μg)混合，充分乳化制成油包水的抗原配劑。第1天給予SJL/J小鼠上腹部皮下注射0.2mL的抗原配劑，第1天和第3天給予靜脈注射0.1 ml(含0.6×106個(gè)百日咳桿菌)百日咳桿菌液。

1.4 動(dòng)物分組及給藥

實(shí)驗(yàn)小鼠共隨機(jī)分為正常組、模型組、激素組、中藥組4組，每組10只。正常組不做任何處理，模型組造模后7d開始每天給予生理鹽水0.2ml灌胃14d，中藥組造模后7d開始每天按每公斤體重2g生藥量給予益腎達(dá)絡(luò)飲0.2ml灌胃14d，激素組造模后7d開始每天按每公斤體重0.078mg給予0.2ml醋酸潑尼松灌胃14d。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)價(jià)

免疫后所有動(dòng)物每天稱體重并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)，動(dòng)物發(fā)病程度的判斷根據(jù)Knono等提出的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)病后動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，可見動(dòng)物尾部無力，尾部無力加肢體無力，肢體輕度麻痹，肢體嚴(yán)重麻痹，被動(dòng)翻身后不能復(fù)原和瀕死狀態(tài)。

1.6 標(biāo)本制作、切片及染色

實(shí)驗(yàn)小鼠在造模后22d取材。免疫組化取材用10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠，剪開胸部將灌注針由左心室穿入主動(dòng)脈，依次注入0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛。經(jīng)心灌注30min后，完整取出腦和脊髓固定于0.1kg/L福爾馬林磷酸緩沖液中24h，石蠟包埋以備切片。取出石蠟塊連續(xù)切片，片厚3μm，37℃烤干切片備用。

蘇木素-伊紅(HE)染色:取石蠟片、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15min;下行梯度酒精各5min;自來水洗20s;Harries蘇木精1min;自來水洗20s;鹽酸酒精10s;自來水洗返藍(lán)10s;伊紅染色10min;自來水洗20s，85%酒精、95%酒精、100%酒精各5s;二甲苯透明各10 min;中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

免疫組化染色(ABC法):切片脫蠟至水，復(fù)合消化液消化，PBS漂洗。加入適當(dāng)稀釋的一抗(p38單抗稀釋為1∶100)，4℃冰箱孵育過夜。加生物素化二抗和ABC復(fù)合物孵育各30min，顯微鏡下觀察，DAB顯色。各步驟前用0.1mol/LPBS(pH7.4)沖洗5min×3次。梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。采用Image-Pro Plus 6.0彩色病理圖文分析系統(tǒng)，在20倍物鏡下由計(jì)算機(jī)自動(dòng)算出陽性物質(zhì)的積分光密度和標(biāo)準(zhǔn)差，對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0 for Windows軟件處理。文中實(shí)驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，進(jìn)行態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，經(jīng) One-Way ANOVA進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，選用S-N-K進(jìn)行多組比較。

2 結(jié)果

2.1 腦組織的病理形態(tài)變化

HE染色后，正常小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞胞核、胞質(zhì)分明，組織無結(jié)構(gòu)紊亂。造模后EAE小鼠出現(xiàn)血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分神經(jīng)細(xì)胞核固縮，灰質(zhì)白質(zhì)均受影響。炎性反應(yīng)在腦室周圍、小腦、腦干都有發(fā)生(圖①②)。

2.2 各組小鼠腦組織 NgR、Gap-43蛋白表達(dá)情況

NgR免疫組化染色胞漿呈棕褐色的細(xì)胞為NgR陽性細(xì)胞。正常腦陽性細(xì)胞較為稀少，染色較淺。在模型組、激素組、中藥組損傷區(qū)域均可見陽性細(xì)胞增多，胞體增大，胞漿深染，主要以彌漫的形式分布在灰質(zhì)區(qū)域(圖③-⑥)。

Gap-43免疫組化染色顯示，胞漿呈棕黃色的細(xì)胞為Gap-43表達(dá)的陽性細(xì)胞。Gap-43正常組中很少表達(dá)，模型組、激素組、中藥組均有表達(dá)，陽性染色物質(zhì)主要沉積于神經(jīng)元。模型組、激素組、中藥組均有表達(dá)(圖⑦-⑩)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)NgR、Gap-43蛋白含量比較

結(jié)果顯示，NgR表達(dá)根據(jù)多項(xiàng)比較組間P值可知，正常組和中藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與其余組比較差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.01);模型組和激素組、中藥組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.01);激素組和中藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Gap-43根據(jù)多項(xiàng)比較組間P值可知，正常組和模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，正常組和激素組、中藥組比較差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均 ＜0.01);模型組和中藥組、激素組比較差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值＜0.01);激素組和中藥組比較差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值＜0.01)。

3 討論

EAE具有與多發(fā)性硬化(MS)相似的臨床表現(xiàn)和病理改變，是國際公認(rèn)的研究人類MS的理想動(dòng)物模型。EAE發(fā)病后伴隨免疫性炎癥的逐漸加重，神經(jīng)功能缺損的癥狀以及病理改變反映出神經(jīng)損傷隨即發(fā)生，因而控制髓鞘脫失、軸突損傷、促進(jìn)神經(jīng)再生已經(jīng)成為本病的研究熱點(diǎn)。CNS再生障礙是腦和脊髓永久性損傷的主要原因，神經(jīng)再生抑制蛋白是阻礙神經(jīng)再生的主要因素之一。目前發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)再生抑制蛋白有很多，其中 MAG、OMgp和 Nogo相繼被分離和鑒定，它們均能通過與Nogo-A受體NgR的結(jié)合而發(fā)揮作用。Nogo-A是目前已知最強(qiáng)的神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子，與特異性NgR結(jié)合［1］，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞軸突的再生并導(dǎo)致軸突生長(zhǎng)錐變性萎縮的功能。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EAE小鼠CNS中NgR含量發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出正常水平，提示 EAE發(fā)病后不僅出現(xiàn)神經(jīng)損傷，同時(shí)表現(xiàn)出神經(jīng)再生被抑制的情況，給予激素、中藥干預(yù)的 EAE小鼠則NgR含量明顯低于模型組水平，證明激素、中藥都可以降低神經(jīng)再生抑制蛋白表達(dá)，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均可下調(diào)Ng R表達(dá)水平，以阻止神經(jīng)元修復(fù)機(jī)制進(jìn)一步受損，恢復(fù)一個(gè)新的生長(zhǎng)抑制與促進(jìn)的平衡。據(jù)此表達(dá)規(guī)律，結(jié)合小鼠減輕的EAE癥狀分析，激素、中藥都可以進(jìn)行干預(yù)其表達(dá)，通過減輕神經(jīng)再生抑制程度促進(jìn)神經(jīng)再生。

Das Sarma J實(shí)驗(yàn)表明，軸突損傷與患病后的肢體殘疾直接相關(guān)，是影響治療和康復(fù)的重要因素，軸突損害越重，MS的預(yù)后越差［2］。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(growth associated protein-43，GAP-43)是神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白，被認(rèn)為是神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)發(fā)育和可塑性的分子標(biāo)記物［3］，與神經(jīng)生長(zhǎng)密切相關(guān)。GAP-43可促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育及突觸的重構(gòu)，在神經(jīng)損傷后修復(fù)時(shí)，軸突內(nèi)GAP-43的含量可增加20～100倍［4］。GAP-43高表達(dá)被認(rèn)為是神經(jīng)生長(zhǎng)修復(fù)的典型特征。單靠CNS損傷后自身有限的可塑能力和損傷刺激產(chǎn)生的有限的GAP-43促進(jìn)神經(jīng)再生常常不足以完全代替神經(jīng)損傷，所以一些無法修復(fù)代償?shù)膿p傷造成了后遺癥。中醫(yī)藥在臨床中治療有神經(jīng)損傷的疾病有一定療效，尤其能改善部分神經(jīng)功能缺損癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EAE發(fā)病神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生也活躍起來，模型組表達(dá)量比較低，中藥益腎達(dá)絡(luò)飲、激素都能促進(jìn)Gap-43表達(dá)量增加，而中藥復(fù)方與激素比較差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床中通過益腎達(dá)絡(luò)飲的治療可以較好減輕神經(jīng)功能缺損程度的療效是一致的。

神經(jīng)再生的障礙是由于神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子及膠質(zhì)瘢痕屏障，很少有神經(jīng)纖維跨越損傷區(qū)而進(jìn)入遠(yuǎn)端，并建立功能性突觸聯(lián)系。如何克服抑制因子的作用和消除膠質(zhì)瘢痕屏障，是今后研究的核心。在消除膠質(zhì)瘢痕方面，目前還沒有有效的辦法。中醫(yī)治療以整體觀念為指導(dǎo)，通過調(diào)整陰陽影響機(jī)體的多個(gè)系統(tǒng)，產(chǎn)生多層面的協(xié)調(diào)作用，此綜合作用體現(xiàn)在降低炎性因子［5］、影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［6］、下調(diào)神經(jīng)再生抑制蛋白表達(dá)、促進(jìn)軸突再生［7］等方面，均對(duì)CNS的反應(yīng)性再生、結(jié)構(gòu)重建起到積極作用，這將對(duì)于CNS損傷的后期康復(fù)治療都具有十分重要的意義。然其表現(xiàn)出的促進(jìn)神經(jīng)再生、抑制瘢痕形成的作用機(jī)制遠(yuǎn)比想象復(fù)雜得多，有待于進(jìn)一步深入研究。`

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