朱世凱 周玉 范平 王博 吳漢青 楊洪吉 熊炯炘 吳河水

·論著·

MT2-MMP基因沉默對缺氧條件下培養(yǎng)的胰腺癌AsPC-1細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲力的影響

朱世凱 周玉 范平 王博 吳漢青 楊洪吉 熊炯炘 吳河水

目的利用特異性siRNA沉默人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的膜型金屬蛋白酶2(MT2-MMP)基因表達(dá)，觀察其對缺氧條件下培養(yǎng)的細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲力的影響。方法采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將插入MT2-MMP特異性siRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞株(siRNA組)，以轉(zhuǎn)染過表達(dá)MT2-MMP質(zhì)粒(過表達(dá)組)或陰性對照質(zhì)粒(空載體組)的AsPC-1作為對照。實時定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的MT2-MMP mRNA和蛋白的表達(dá)。在缺氧條件(37℃、1% O2、5% CO2、飽和濕度的三氣培養(yǎng)箱)下培養(yǎng)后，應(yīng)用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡，Transwells小室檢測細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果成功獲取MT2-MMP基因沉默的AsPC-1細(xì)胞株和過表達(dá)的細(xì)胞株。缺氧條件下培養(yǎng)24 h后，空載體組、過表達(dá)組、siRNA組細(xì)胞增殖的吸光度值(A490值)分別為0.68±0.08、0.80±0.08、0.52±0.07；細(xì)胞凋亡率分別為(6.2±1.5)%、(2.8±1.1)%、(21.4±3.9)%；每個視野(200倍)的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(115.8±23.2)、(256.4±38.6)、(45.8±18.2)個。siRNA組較空載體組的細(xì)胞增殖顯著被抑制，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少，而細(xì)胞凋亡率顯著增加(P值均<0.05)。過表達(dá)組較 空載體組的細(xì)胞增殖顯著增強，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增加，而細(xì)胞凋亡率顯著降低(P值均<0.05)。結(jié)論MT2-MMP基因沉默的AsPC-1細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)后細(xì)胞凋亡增加，增殖被抑制，侵襲力減弱。

胰腺腫瘤； 基質(zhì)金屬蛋白酶類； RNA，小分子干擾； 缺氧； 細(xì)胞凋亡； 腫瘤浸潤

細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix，ECM)的降解是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是人體內(nèi)降解ECM的主要酶類。近來研究發(fā)現(xiàn)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(membrane type matrix metalloproteinase), MT-MMP)是MMPs家族中新近發(fā)現(xiàn)的一個跨膜蛋白，有MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP、MT4-MMP4個成員。能夠直接作用于多種細(xì)胞外基質(zhì)成分和細(xì)胞黏附分子，在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，缺氧微環(huán)境的適應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)降解在腫瘤早期發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，且二者間存在著多種聯(lián)系[3-4]。本研究通過沉默人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞MT2-MMP的表達(dá)，探討其對缺氧條件下胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲作用的影響。

材料和方法

一、材料與試劑

人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所；插入靶向MT2-MMP的siRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒pSilencer-MT2-MMP、過表達(dá)MT2-MMP的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/His-MT2-MMP和含陰性對照siRNA的質(zhì)粒pSilencer-Control均由上海吉凱公司構(gòu)建并測序鑒定；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；胎牛血清(FBS)和DMEM購自美國Gibco公司；鼠抗人MT2-MMP單抗購自美國Abcam公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗購自武漢博士德生物公司；CCK-8試劑購自美國sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；Matrigel膠購自美國BD公司；Transwell小室(8 μm)購自美國Costar公司；BCA蛋白定量試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司；蛋白預(yù)染Marker購自美國Fermentas公司；其余試劑均為分析純。

二、方法

1．細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：AsPC-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞2.5×105個接種于35 mm培養(yǎng)皿中，置無抗生素的含有10% FBS的DMEM中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%融合時，采用LipofectamineTM2000將3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，命名為空載體組(轉(zhuǎn)染pSilencer-Control)、過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/His-MT2-MMP)和siRNA 組(轉(zhuǎn)染pSilencer-MT2-MMP)。轉(zhuǎn)染后24 h按1∶9的比例傳代，48 h后開始用含500 μg/ml G-418的選擇性培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，2～3周后克隆形成。以克隆環(huán)挑取細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)移至6 孔板擴(kuò)大培養(yǎng)、傳代，最后轉(zhuǎn)入60 ml培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

2．MT2-MMP mRNA表達(dá)檢測：提取各組細(xì)胞總RNA，取1 μg逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。MT2-MMP上游引物5′-CTGCGGCTTTATGGCTACCT-3′，下游引物5′-CTCATAGGGCACCTCCTGGAA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物387 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′，下游引物5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物190 bp。引物由上海英俊公司合成。應(yīng)用SYBR Green Ⅰ熒光染料技術(shù)行實時定量PCR，擴(kuò)增條件：94℃ 4 min，94℃ 30 s、51℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個循環(huán)，獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用計算機分析Ct值，采用2-△△Ct公式計算mRNA表達(dá)量。

3．MT2-MMP蛋白表達(dá)檢測：提取各組細(xì)胞總蛋白，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測MT2-MMP 蛋白的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。兔抗人MT2-MMP單抗1∶1000稀釋，最后加入ECL發(fā)光。采用電泳凝膠成像分析軟件掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值代表蛋白表達(dá)量。

4．細(xì)胞增殖能力檢測：取各組對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25% Trypsin消化成單細(xì)胞懸液，取100 μl接種于96孔板，每孔1×104個細(xì)胞，加入100 μl含10%FBS的高糖DMEM，置37℃、1% O2、5% CO2、飽和濕度的三氣培養(yǎng)箱中孵育12、24、36、72 h，各孔內(nèi)加入10 μl的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，測各孔在450 nm波長的吸光度值(A450值)。每組設(shè)3個復(fù)孔，取均值，繪制細(xì)胞生長曲線。

5．細(xì)胞凋亡檢測：取各組對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，置37℃、1% O2、5% CO2、飽和濕度的三氣培養(yǎng)箱中孵育24 h，收集細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的1×PBS洗滌細(xì)胞2次，取5～10萬個細(xì)胞，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，再加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻，室溫(20～25℃)避光孵育10 min，離心棄上清。加入190 μl Annexin V-FITC結(jié)合液(1×)輕輕重懸細(xì)胞，加入10 μl碘化丙啶染色液混勻，冰浴避光放置，隨即上流式細(xì)胞儀檢測。

6．體外細(xì)胞侵襲力檢測：用Matrigel包被Transwell小室底部膜的上室面后，上室加入100 μl用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h的細(xì)胞(1×104個)，下室加入500 μl含10% FBS的DMEM，置37℃、1% O2、5% CO2、飽和濕度的三氣培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦去上室內(nèi)未穿膜的細(xì)胞，用甲醛固定穿膜細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機選取8個視野計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞MT2-MMP基因的表達(dá)

空載體組、過表達(dá)組、siRNA組AsPC-1細(xì)胞的MT2-MMP mRNA表達(dá)水平分別為0.30±0.11、0.72±0.16、0.10±0.04；蛋白表達(dá)量分別為0.32±0.10、0.74±0.15、0.12±0.05(圖1)。過表達(dá)組細(xì)胞MT2-MMP mRNA及蛋白的表達(dá)量均顯著高于空載體組(t值分別為4.867、 5.167,P值均=0.001)，而siRNA組的表達(dá)量較空載體組顯著下降(t值分別為3.918、4.069,P值均=0.004)。

圖1空載體組、過表達(dá)組、siRNA組AsPC-1細(xì)胞MT2-MMP蛋白表達(dá)

二、缺氧條件培養(yǎng)下AsPC-1細(xì)胞增殖的變化

在缺氧條件培養(yǎng)下，空載體組細(xì)胞隨培養(yǎng)時間的延長而穩(wěn)定增殖；過表達(dá)組細(xì)胞的增殖較空載體組顯著增加，24、36、72 h時的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為2.42、4.30、4.16，P值<0.05或<0.01)；siRNA組細(xì)胞的增殖較空載體組顯著減少，24、36、72 h時的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為3.381、7.936、13.643，P值均<0.01，表1，圖2)。

表1 缺氧條件下3組AsPC-1細(xì)胞的A450值

注：與空載體組比較，aP<0.05；bP<0.01

圖2 缺氧條件下3組AsPC-1細(xì)胞的生長曲線

三、缺氧條件培養(yǎng)下AsPC-1細(xì)胞凋亡的變化

在缺氧條件下培養(yǎng)24 h，空載體組、過表達(dá)組、siRNA組細(xì)胞的凋亡率分別為(6.2±1.5)%、(2.8±1.1)%、(21.4±3.9)%。過表達(dá)組細(xì)胞的凋亡率較空載體組顯著下降(t=4.018,P=0.003)，而siRNA組細(xì)胞的凋亡率較空載體組顯著增加(t=8.077,P<0.01，圖3)。

圖3缺氧條件下培養(yǎng)24 h后空載體組、過表達(dá)組、siRNA組的凋亡細(xì)胞 (流式細(xì)胞法)

四、缺氧條件培養(yǎng)下AsPC-1細(xì)胞侵襲力的變化

在缺氧條件下培養(yǎng)24 h，空載體組、過表達(dá)組、siRNA組每個視野的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(115.8±23.2)、(256.4±38.6)、(45.8±18.2)個。過表達(dá)組的穿膜細(xì)胞數(shù)較空載體組顯著增加(t=7.181,P<0.01)，而siRNA組的穿膜細(xì)胞數(shù)較空載體組顯著減少(t=5.979,P<0.01，圖4)。

圖4缺氧條件下培養(yǎng)24 h后空載體組(a)、過表達(dá)組(b)、siRNA組(c)的穿膜細(xì)胞(×200)

討 論

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜、多步驟的過程。ECM的降解是腫瘤細(xì)胞突破基質(zhì)屏障向周圍組織浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，與惡性腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。金屬蛋白酶-2(MMP-2)是降解ECM主要組分的關(guān)鍵酶之一，其激活取決于膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT-MMP)與MMP抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)間的平衡[5-6]。MT2-MMP高表達(dá)于多種人類惡性腫瘤組織，如胰腺癌、結(jié)腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等，定位于癌細(xì)胞的表面，直接或間接激活MMPs降解ECM，還參與對多種細(xì)胞信號通路的調(diào)控，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中起著重要的作用[7-11]。Ellenrieder等[8]研究發(fā)現(xiàn)，MT2-MMP能夠直接激活MMP-2，參與胰腺癌發(fā)生和惡性進(jìn)展的過程。

缺氧微環(huán)境是存在人類實體瘤內(nèi)部的一種較為普遍的現(xiàn)象。為了自身克服和適應(yīng)缺氧微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞會發(fā)生一系列適應(yīng)性改變，包括調(diào)控大量涉及與腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡、新生血管形成、能量與物質(zhì)代謝以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等重要過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧同樣也可調(diào)控多種MMPs家族成員的基因表達(dá)，參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，MT2-MMP表達(dá)沉默的AsPC-1細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)后其凋亡增加，增殖被抑制，且細(xì)胞的侵襲力也被抑制；相反，MT2-MMP過表達(dá)的AsPC-1細(xì)胞的增殖與侵襲力顯著增強，說明MT2-MMP是一種與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)的癌基因，這為胰腺癌的基因治療提供了一個新的切入點。

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EffectsofMT2-MMPsilencingontheproliferation,apoptosisandinvasionofpancreaticcancercellAsPC-1underhypoxiaculture

ZHUShi-kai,ZHOUYu,FANPing,WANGBo,WUHan-qing,YANGHong-ji,XIONGJiong-xin,WUHe-shui.

CenterofOrganTransplantation&HepatobiliaryandPancreaticSurgery,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu610072,China

ZHUShi-kai,Email：zhushikai37@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of MT2-MMP silencing by specific siRNA on pancreatic cancer cell AsPC-1 proliferation, apoptosis and invasion under hypoxia culture.MethodsMT2-MMP siRNA plasmids were stably transfected into AsPC-1 cells (siRNA group) by liposome transfection method, AsPC-1 cells tranfected with and over-expressed MT2-MMP siRNA plasmids (over-expression group) and negative control plasmid (empty vector group) were treated as control. Real-time RT-PCR and Western Blot assay were used to detect the expression of MT2-MMP mRNA and protein. Under culture with hypoxia (37℃, 1% O2, 5% CO2, three gas saturated humidity incubator), CCK-8, flow cytometry (FCM) and Transwell assays were applied to measure pancreatic cancer cell proliferation, apoptosis, and invasion.ResultsMT2-MMP silencing AsPC-1 and over-expressed AsPC-1 were successfully established. After culture with hypoxia for 24 h, the absorbance values (A490) in empty vector group, over-expression group and siRNA group were 0.68±0.08, 0.80±0.08, 0.52±0.07; the apoptotic rates were (6.2±1.5)%, (2.8±1.1)%, (21.4±3.9)%, and the numbers of invasion cells in each field (200 times) were (115.8±23.2), (256.4±38.6), (45.8±18.2). The proliferation in MT2-MMP siRNA group was significantly inhibited, the numbers of invasion cells was significantly decreased, but the apoptotic rates were obviously increased when compared with those in empty vector group (P<0.05). The proliferation in over-expression group was significantly enhanced, the numbers of invasion cells was significantly increased, but the apoptotic rates were obviously decreased when compared with those in empty vector group (P<0.05).ConclusionsAsPC-1 with MT2-MMP silencing could inhibit pancreatic cancer cells proliferation, induce cells apoptosis and attenuate tumor invasion under hypoxia culture.

Pancreatic neoplasms； Matrix metalloproteinases; siRNA； Anoxia； Apoptosis； Neoplasm invasiveness

2013-06-21)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.005

610072 成都，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院器官移植中心肝膽胰外科(朱世凱、周玉、楊洪吉)；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺疾病研究所(范平、王博、吳漢青、熊炯炘、吳河水)

朱世凱，Email：zhushikai37@163.com