張方信 李文祥 鄧芝云 張盼 陳嘉嶼 鄧尚新 王秀鋒 賈紅梅 茍艷子

·論著·

大黃甘草湯對高原急性壞死性胰腺炎合并腸損傷大鼠的影響

張方信 李文祥 鄧芝云 張盼 陳嘉嶼 鄧尚新 王秀鋒 賈紅梅 茍艷子

目的觀察大黃甘草湯對高原急性壞死性胰腺炎(P-ANP)并發(fā)腸損傷大鼠的治療效果。方法54只Wistar大鼠，由蘭州市運至馬銜山(海拔3848米)適應性喂養(yǎng)1個月。按完全隨機法分為假手術組、P-ANP組、大黃甘草湯組，每組18只。采用逆行胰膽管注射4%?；悄懰徕c方法制備P-ANP模型。大黃甘草湯組于造模前2 h、造模后每12 h給予大黃甘草湯0.6 ml/100 g體質(zhì)量灌胃，假手術組和P-ANP組給予等容積生理鹽水灌胃。術后6、12、24 h分批處死大鼠，取胰腺及小腸組織行組織病理學檢查并評分，透射電鏡觀察腸黏膜超微結(jié)構(gòu)變化。采用ELISA法檢測小腸組織IL-10、TNF-α表達水平。結(jié)果造模后12 h，假手術組、P-ANP組、大黃甘草湯組的胰腺病理評分為(0.33±0.52)、(8.33±0.52)、(6.17±2.13)分；腸組織病理評分為(0.17±0.41)、(3.83±1.17)、(2.17±1.17)分。P-ANP組和大黃甘草湯組胰腺、小腸病理評分均顯著高于假手術組(P值均<0.01)，大黃甘草湯組又均顯著低于同時間點的P-ANP組(P值均<0.05)，且大黃甘草湯組腸組織和胰腺組織病理學損傷呈正相關(r=0.796，P<0.01)。P-ANP組大鼠腸黏膜超微結(jié)構(gòu)損傷嚴重，而大黃甘草湯組較P-ANP組損傷明顯減輕。造模后12 h，假手術組、P-ANP組、大黃甘草湯組小腸組織IL-10水平分別為(136.68±13.98)、(762.21±79.58)、(896.36±84.87)pg/g，TNF-α水平分別為(353.05±76.21)、(1913.87±259.33)、(1481.58±231.47)pg/g，P-ANP組和大黃甘草湯組IL-10、TNF-α水平均較假手術組顯著增高，大黃甘草湯組IL-10水平又較P-ANP組顯著增高(P<0.05)，但TNF-α水平則較P-ANP組顯著降低(P<0.05)。結(jié)論大黃甘草湯可迅速改善P-ANP大鼠并發(fā)的腸損傷。

胰腺炎，急性壞死性； 缺氧； 腸黏膜； 通透性； 大黃甘草湯

重癥急性胰腺炎(SAP)是臨床上常見的急腹癥。高原地區(qū)特殊的自然環(huán)境和飲食習慣等因素導致的高原性SAP(plateau severe acute pancreatitis，P-SAP)更具有易發(fā)生、難治療、易合并多種器官損傷等特征。大量研究證實，SAP時常存在腸黏膜屏障損傷[1]，腸黏膜的通透性增加，引起腸道細菌及內(nèi)毒素易位，導致胰腺組織繼發(fā)感染，繼而發(fā)生全身炎癥反應綜合征或多器官功能障礙綜合征[2]，這是SAP病死率居高不下的主要原因。大黃與甘草配伍的經(jīng)典方劑大黃甘草湯出自《金匱要略》，苦寒與甘平相結(jié)合，能清、能下、能通，解毒而不傷正。本研究觀察大黃甘草湯對天然高原環(huán)境下急性壞死性胰腺炎(ANP)合并腸損傷大鼠的影響，為臨床治療提供必要的理論及實驗依據(jù)。

材料與方法

一、動物分組與高原缺氧ANP模型的建立

54只Wistar大鼠，購于蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院實驗動物中心，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量220～280 g。用汽車運至蘭州馬銜山(海拔3848 m)適應性喂養(yǎng)1個月，按完全隨機法分為假手術組、P-ANP組和大黃甘草湯組，每組18只。采用逆行胰膽管緩慢注入4%?；悄懰徕c(Sigma公司)0.1 ml/100 g體質(zhì)量的方法制備ANP模型。假手術組僅開腹后輕翻胰腺組織。大黃甘草湯組于造模前2 h及造模后1次/12 h給予大黃甘草湯0.6 ml/100 g體質(zhì)量灌胃。大黃甘草湯方劑：大黃12 g，甘草3 g，由蘭州總醫(yī)院藥劑科提供，最終濃度為0.25 g/ml。假手術組及P-ANP組大鼠在相應時間點給予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠術后均于背部皮下注入生理鹽水2 ml/100 g體質(zhì)量以補充術中丟失的體液[3]。術后6、12、24 h分批處死大鼠。

二、胰腺及小腸組織病理學檢查

處死大鼠后迅速取部分胰尾部組織及距回盲部5 cm處取5 cm腸組織置10%中性甲醛中固定，常規(guī)病理檢查，并采用改良的Schmidt評分[4]及Chiu′s六級評分[5]分別對胰腺及小腸組織進行評分。

三、小腸組織超微結(jié)構(gòu)檢查

處死大鼠后迅速取上端空腸2 cm長的組織置入3%戊二醛中固定，依次脫水、包埋、超薄切片及醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色，在透射電鏡下觀察腸黏膜組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

四、小腸組織IL-10、TNF-α表達水平檢測

稱取0.1 g保存于液氮中的小腸組織，加入0.9 ml預冷的PBS液，制備組織勻漿，離心取上清液，-20℃保存。采用ELISA試劑盒(R&D公司)檢測小腸組織的IL-10、TNF-α表達水平。

五、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、胰腺及小腸組織病理變化

肉眼觀假手術組大鼠胰腺大小、形態(tài)、色澤均正常，無腹腔積液。P-ANP組大鼠胰腺出現(xiàn)片狀或全胰壞死，質(zhì)硬，與周圍組織廣泛粘連；腸系膜可見廣泛的點狀皂化斑，大量血性腹水。大黃甘草湯組胰腺壞死面積較小，壞死程度較輕，有的只見胰腺充血，未見壞死，與周圍組織粘連不廣泛；腸系膜皂化斑較少，腹水不明顯。

光鏡下見假手術組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)基本正常(圖1a)；P-ANP組大鼠胰腺彌漫性出血及片狀壞死，周圍間質(zhì)水腫，血管擴張、充血，間質(zhì)和胰腺小葉大量炎癥細胞浸潤(圖1b)；大黃甘草湯組大鼠胰腺腺泡細胞變性，腺小葉結(jié)構(gòu)輕度破壞，少量炎癥細胞浸潤，間質(zhì)水腫，但充血不明顯(圖1c)。假手術組大鼠腸組織結(jié)構(gòu)基本正常(圖1d)；P-ANP組大鼠腸黏膜絨毛頂端出現(xiàn)上皮下間隙，部分組織黏膜上皮脫落，上皮與固有層分離，間質(zhì)裸露、水腫，炎性細胞浸潤，中央乳糜管擴張(圖1e)；大黃甘草湯組大鼠腸黏膜的損傷程度較P-ANP組明顯減輕，僅有部分腸絨毛頂端出現(xiàn)上皮下間隙，偶見上皮層與固有層分離，且分離程度較輕(圖1f)。

圖1假手術組、P-SAP組、大黃甘草湯組24 h點胰腺組織及小腸組織的病理改變(×100)

P-ANP組、大黃甘草湯組的胰腺及腸組織的病理評分均隨時間延長而逐漸增加，并顯著高于假手術組(P值均<0.01)。但大黃甘草湯組的病理評分均較同時間點的P-ANP組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表1)，且胰腺組織與腸組織的病理評分呈正相關(r=0.796，P<0.01)。

二、腸黏膜組織透射電鏡變化

假手術組大鼠腸上皮超微結(jié)構(gòu)基本正常(圖2a)。P-ANP組大鼠腸黏膜的微絨毛倒伏，縮短、稀疏、缺損，腸上皮結(jié)構(gòu)及細胞間緊密連接不清，微絨毛上皮細胞的胞核固縮、裸露，核周間隙增寬，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡變性(圖2b)，并隨時間的延長而加重。大黃甘草湯組大鼠腸黏膜上皮輕度腫脹，微絨毛排列輕度紊亂、脫失，部分縮短、斷裂，細胞內(nèi)腫脹的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少見，細胞間緊密連接較明顯，細胞間隔增寬程度較P-ANP組減輕(圖2c)。

表1 各組胰腺及小腸組織的病理學評分

注：與假手術組比較，aP<0.01，與P-ANP組比較，bP<0.05

圖2假手術組(a)、P-ANP組(b)、大黃甘草湯組(c)大鼠小腸黏膜的超微結(jié)構(gòu)變化(a：×5000,b：×8000,c：×20000)

三、小腸組織IL-10、TNF-α表達變化

假手術組小腸組織IL-10、TNF-α水平均無明顯

變化。P-ANP組和大黃甘草湯組IL-10、TNF-α水平均較假手術組顯著增高；IL-10水平呈時間依賴性逐漸降低，而TNF-α水平呈時間依賴性逐漸增高。大黃甘草湯組IL-10水平較P-ANP組顯著增高，但TNF-α水平較P-ANP組顯著降低(P值均<0.05，表2)。

組別時點(h)只數(shù)IL-10TNF-α假手術組66132.77±11.49358.77±75.83126136.68±13.98353.05±76.21246137.80±12.82346.36±72.28P-ANP組66902.19±58.03a1664.21±301.50a126762.21±79.58a1913.87±259.33a246689.32±89.72a2225.10±324.63a大黃甘草湯組661031.91±95.35ab1216.58±249.21ab126896.36±84.87ab1481.58±231.47ab246808.58±91.16ab1776.53±221.09ab

注：與假手術組比較，aP<0.01，與P-ANP組比較，bP<0.05

討 論

SAP時腸損傷十分常見，且常發(fā)生在其他臟器損傷之前，對疾病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸有重要影響[6]。高原地區(qū)SAP患者合并腸損傷較平原地區(qū)SAP患者更嚴重，其原因可能有：(1)高原低氧可引起紅細胞代償性增生、血細胞比容升高，加之高原人群習慣進食牛羊肉等含脂量高的食物，使血液黏稠度增高，易導致胰腺及腸黏膜微循環(huán)障礙[7]；(2)腸道是缺氧敏感器官，高原缺氧條件容易使腸組織發(fā)生損傷，而腸損傷又可作為繼發(fā)癥狀，加重原有病情[8]；(3)低氧環(huán)境下，機體各種細胞因子處于高水平狀態(tài)，當SAP時，細胞因子失衡發(fā)生更早、更嚴重；(4)高原環(huán)境下胰腺組織缺血、缺氧產(chǎn)生的氧自由基、中性粒細胞激活及缺血-再灌注損傷是SAP時潛在的損傷因素[9]。此外，炎癥因子，尤其是抗炎因子IL-10和促炎因子TNF-α，在SAP的發(fā)生、發(fā)展過程中也起著重要作用。Norman等[10]發(fā)現(xiàn)，ANP發(fā)生30 min后，大鼠胰腺組織TNF-α mRNA高表達，隨ANP進展，在肺及肝臟等器官組織中也可檢測到TNF-α mRNA的表達增加。

近年來，中醫(yī)學認為SAP的病因病機為飲食傷胃，肝膽失調(diào)，導致肝脾郁滯，熱、濕、瘀蘊結(jié)中焦，由于肝膽和脾胃功能失調(diào)，疏泄不利，氣機不暢，氣滯血瘀而發(fā)病。根據(jù)中醫(yī)“六腑以通為用”的原則，使用通腑瀉下的方法，可有效消除SAP早期出現(xiàn)的腹脹，減輕腹壓，通暢胰膽管，改善腹腔臟器血液供應。大黃甘草湯以大黃為主，配甘草組成，大黃可促進腸道蠕動及腸黏膜血液循環(huán)，加快腸道細菌和毒素排泄，減少細菌易位的機會，促進損傷的腸黏膜修復，防止小血栓形成，改善胰腺及腸組織微循環(huán)[11]。甘草具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥等功效，具有抗菌、抗炎、抗變態(tài)反應以及非特異性免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[12]，還具有解痙、抗?jié)?、保肝作用。有研究報道，大黃甘草湯治療SAP可明顯改善患者肝腎功能及全身情況，縮短住院時間，減少并發(fā)癥[13]。

本研究結(jié)果顯示，高原ANP大鼠腸黏膜損傷嚴重，腸組織病理損傷與胰腺損傷呈正相關關系。此外，P-ANP組大鼠腸組織中TNF-α水平呈時間依賴性升高，IL-10的水平在造模后顯著上升，隨后呈時間依賴性降低，導致抗炎細胞因子的相對不足，提示炎癥遞質(zhì)過度釋放與腸屏障損傷可能在P-ANP的發(fā)生、發(fā)展過程中形成了某種協(xié)同效應。

總之，大黃甘草湯能迅速減輕高原ANP大鼠胰腺及腸組織損傷。大黃、甘草來源廣泛，價格低廉，使用方便，可成為治療高原SAP的常規(guī)輔助藥物。

[1] Liu ZH, Peng JS, Li CJ, et al. A simple taurocholate-induced model of severe acute pancreatitis in rats. World J Gastroenterol, 2009,15: 5732-5739.

[2] Zhang XP, Zhang J, Song QL, et al. Mechanism of acute pancreatitis complicated with injury of intestinal mucosa barrier. J Zhejiang Univ Sci B, 2007,8: 888-895.

[3] 唐丙喜, 鄧芝云, 孔祥才, 等. 大黃甘草湯對急性壞死性胰腺炎大鼠并發(fā)的肺損傷的影響. 中華胰腺病雜志, 2010,10: 180-183.

[4] Schmidt J, Lewandrowsi K, Warshaw AL, et al. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. Int J Pancreatol, 1992,12: 41-51.

[5] Chiu CJ, McArdle AH, Brown R, et al. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Arch Surg, 1970,101: 478-483.

[6] Capurso G, Zerboni G, Signoretti M, et al. Role of the gut barrier in acute pancreatitis. J Clin Gastroenterol, 2012,46: S46-S51.

[7] 張盼, 張方信. 高原缺氧環(huán)境下重癥急性胰腺炎的發(fā)病機制和治療進展. 醫(yī)學綜述, 2010,16: 2411-2414.

[8] 吳文明, 張方信, 張盼, 等. 高原缺氧條件對大鼠腸黏膜組織及缺氧誘導因子-1α、誘導型一氧化氮合酶表達的影響. 解放軍醫(yī)學雜志, 2010,35: 592-594+600.

[9] Rahman SH, Ammori BJ, Holmfield J, et al. Intestinal hypoperfusion contributes to gut barrier failure in severe acute pancreatitis. J Gastrointest Surg, 2003,7: 26-35.

[10] Norman JG, Fink G, Franz M, et al. Active interleukin-1 receptor required for maximal progression of acute pancreatitis. Ann Surg, 1996, 22:163-169.

[11] 陳德昌, 馬麗瓊, 劉紹澤. 大黃對膿毒癥大鼠腸道細菌及其移位的影響. 中國危重病急救醫(yī)學, 2009,21: 17-20.

[12] 王巧娥, 任虹, 曹學麗. 甘草研究開發(fā)與利用現(xiàn)狀. 中國農(nóng)學通報, 2011,22: 290-295.

[13] 張方信, 唐丙喜, 鄧芝云, 等. 大黃甘草湯在重癥急性胰腺炎患者中的治療觀察. 臨床消化病雜志, 2010,22: 38-41.

EffectofDahuangGancaodecoctiononintestinalinjurycausedbyacutenecrotizingpancreatitisatplateau

ZHANGFang-xin,LIWen-xiang,DENGZhi-yun,ZHANGPan,CHENJia-yu,DENGShang-xin,WANGXiu-feng,JIAHong-mei,GOUYan-zi.

DepartmentofGastroenterology,GeneralHospitalofLanzhouCommand,Lanzhou730050,China

DENGZhi-yun,Email：liwenx11@126.com

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of dahuang gancao decoction on intestinal injury caused by plateau acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsFifty-four Wistar rats were transported from Lanzhou to Maxianshan (altitude 3848 m) for 30 days adaptive feeding, then they were randomly divided into 3 groups (n=18 in each group), namely sham-operated group (SO), P-ANP group (P-ANP), dahuang gancao decoction intervention group (DG). P-ANP model was induced by retrograde injection of 4% sodium taurocholate into the biliary and pancreatic duct. Dahuang gancao decoction 0.6 ml/100 g weight was gavaged 2 h before and every 12 h after P-ANP model induction. The same volume of normal saline was gavaged in the SO and P-ANP group. After 6, 12, 24 h, all rats were sacrificed, and pancreas and intestine tissues were harvested to observe the pathological changes. The change of intestinal mucosal ultrastructure was observed under transmission electron microscope. The expression of IL-10, TNF-α in intestinal tissue was determined by ELISA.Resultstwelve hours after P-ANP induction, the pancreas pathological scores were 0.33±0.52, 8.33±0.52, 6.17±2.13; the intestine pathological scores were 0.17±0.41, 3.83±1.17, 2.17±1.17 in SO group, P-ANP group and DG group. The values in P-ANP group and DG group were significantly higher than that in SO group (P<0.01), and the corresponding values in DG group were significantly lower than that in P-ANP group (P<0.05), and there was a positive association between pancreas and intestine injuries (r=0.796,P<0.01). The injury of intestinal mucosal ultrastructure in P-ANP groups was severe; however, the injury was less severe in DG group. Twelve hours after ANP induction, the IL-10 levels in intestinal tissue were (136.68±13.98), (762.21±79.58), (896.36±84.87) pg/g; the TNF-α levels in intestinal tissue were (353.05±76.21), (1913.87±259.33), (1481.58±231.47) pg/g in SO group, P-ANP group and DG group. The values in P-ANP group and DG group were significantly higher than that in SO group, and the corresponding values of IL-10 in DG group were significantly higher than that in P-ANP group (P<0.05), but the corresponding values of TNF-α were significantly lower than that in P-ANP group (P<0.05).ConclusionsDahuang gancao decoction may quickly improve intestine injury caused by P-ANP in rats.

Pancreatitis, acute necrotizing; Anoxia; Intestinal mucosa; Permeability; Dahuang gancao decoction

2013-05-30)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.008

全軍后勤科研計劃(CLZ12J005)

730050 蘭州，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院消化科(張方信、張盼、陳嘉嶼、鄧尚新、王秀鋒、賈紅梅、茍艷子)，檢驗科(鄧芝云)；蘭州大學第二臨床醫(yī)學院消化科(李文祥)

鄧芝云，Email：liwenx11@126.com