那 迪，姜成鋼，徐 昊，徐 巖，王振寧，徐惠綿

腹膜轉(zhuǎn)移是影響胃癌手術(shù)預(yù)后的重要原因之一，是否轉(zhuǎn)移直接關(guān)系術(shù)后生存率［1］。腹膜轉(zhuǎn)移會顯著加劇胃癌晚期的進程及惡化程度，然而轉(zhuǎn)移的機制仍不十分明晰。腹膜為癌細胞轉(zhuǎn)移提供了所需的炎性介質(zhì)，在癌腹膜轉(zhuǎn)移早期，由癌細胞、成纖維細胞、間皮細胞等分泌的細胞因子作用于間皮細胞，使間皮細胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)功能上發(fā)生改變，為腹膜轉(zhuǎn)移提供“土壤”［2］。間皮細胞通過抵御腫瘤釋放的因子來阻止腫瘤細胞浸潤［3］。在對癌細胞浸潤間皮細胞的研究中，Buck等把Walker 256癌細胞接種到間皮細胞受損的小鼠腹腔內(nèi)后，觀察到癌細胞在受損區(qū)域迅速種植生長，而間皮細胞完好的小鼠卻很少發(fā)生轉(zhuǎn)移［4］。推測胃癌細胞可以破壞腹膜間皮細胞，從而形成腹膜轉(zhuǎn)移，而黃芪具有抗腫瘤作用［5］，可間接保護腹膜間皮細胞?；谏鲜黾僭O(shè)，筆者擬建立胃癌細胞對腹膜間皮細胞的損傷模型，并檢測黃芪對腹膜間皮的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 試劑:黃芪提取液購自正大青春寶公司;MTT、33258染料購自Sigma公司;FCS、DMEM、PI均購自Biosharp公司。細胞系:人胃癌細胞株MKN45由中國醫(yī)科大學(xué)細胞生物教研室提供。人腹膜間皮細胞系由中南大學(xué)湘雅二院彭佑銘教授饋贈(細胞株由法國巴黎TENON醫(yī)院Pierre RONCO教授建立)。

1.2 方法

1.2.1 光鏡下人腹膜間皮細胞形態(tài)學(xué)變化 人腹膜間皮細胞系用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)，至生長到對數(shù)期分3組:對照組為只加DMEM培養(yǎng)液的間皮細胞;實驗組1為間皮細胞加胃癌MKN45細胞上清;實驗組2為間皮細胞加胃癌MKN45細胞上清與黃芪提取液共培養(yǎng)。光鏡下觀察作用24 h后腹膜間皮細胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2 MTT檢測黃芪作用后人腹膜間皮細胞生長曲線 分組同上。分別于共培養(yǎng)12、24、48 h后加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除孔內(nèi)液體，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩 10 min，酶標(biāo)儀檢測 490 nm波長處各孔的吸收度，檢測間皮細胞存活率，并繪制生長曲線。存活率=實驗組光吸收值/對照組光吸收值×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 分組同上，培養(yǎng)24、48 h后用0.25%胰蛋白酶適度消化細胞，離心，分別制備各組單細胞懸液。移入新的1.5 mL離心管中，4℃ 500×g，離心5 min，形成細胞團。小心移去上清液，冰預(yù)冷PBS洗細胞2次，保證每管細胞數(shù)至少106個細胞，上機檢測，檢測細胞凋亡率。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察間皮細胞凋亡情況 將蓋玻片置于6孔板底，間皮細胞(1×106/孔)接種過夜，分組同上。黃芪提取液濃度為100 μg/mL，作用24 h，PBS洗2次，加入固定液(甲醇與冰乙酸的體積比為3∶1)固定15 min，PBS洗2次，加Hoechst 33258熒光染料(0.5 mL)，37℃避光孵育20 min，熒光顯微鏡下觀察，照相。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，應(yīng)用Student's t-檢驗進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下腹膜間皮細胞形態(tài)學(xué)改變 對照組間皮細胞呈多邊形，排列完整，連續(xù)單層鋪路石樣特征(圖1A)。而接觸胃癌上清后的間皮細胞變小，形狀不規(guī)則，細胞連接松散，有的區(qū)域細胞大面積脫落形成暴露區(qū)(圖1B)。胃癌上清與黃芪提取液共培養(yǎng)組可見細胞數(shù)目較單純胃癌上清組增多，較致密，偶見細胞脫落，未見大面積裸露區(qū)(圖1C)。

圖1 光鏡下腹膜間皮細胞形態(tài)學(xué)改變

2.2 MTT檢測黃芪對人腹膜間皮細胞保護作用實驗組1與實驗組2于24、48 h間皮細胞存活率分別為47.32%、19.81%，67.25%、34.11%。各組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見圖2。

圖2 不同時間點胃癌上清單獨或聯(lián)合黃芪作用下間皮細胞存活率比較

2.3 流式細胞儀檢測黃芪提取液培養(yǎng)的間皮細胞對胃癌細胞上清的抵御作用 對照組與實驗組1、實驗組2在24、48 h凋亡率分別為12.45% ±7.42%、24.96% ±9.17%，54.10% ±14.19%、82.70% ±31.22%，38.20% ±4.23%、52.20% ±7.54%。兩組在各時間點的凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 不同時間點胃癌上清單獨或聯(lián)合黃芪提取液作用下間皮細胞凋亡率比較(%)

2.4 Hoechst 33258熒光染色觀察間皮細胞凋亡在胃癌上清作用24 h后間皮細胞發(fā)生明顯改變，間皮細胞大量脫落，可見核溶解、碎裂、核固縮等凋亡特征(圖3A)。黃芪提取液與胃癌上清共同作用24 h后，比胃癌上清單獨作用組凋亡的細胞量明顯減少，間皮細胞排列規(guī)則，偶見凋亡特征(圖3B)。

圖3 Hoechst 33258熒光染色觀察間皮細胞凋亡變化(熒光顯微鏡×200)

3 討論

研究表明，胃癌細胞可以通過對間皮細胞的破壞來達到腹膜轉(zhuǎn)移的目的，Paget提出了“種子-土壤”學(xué)說，即腹膜成為胃癌細胞種植適宜的“土壤”［6-7］。本實驗通過光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞上清作用間皮細胞后，間皮細胞體積變小，形態(tài)不規(guī)則，細胞連接松散，甚至出現(xiàn)大面積脫落。MTT檢測發(fā)現(xiàn)，胃癌上清作用后，間皮細胞存活率顯著下降，說明胃癌細胞具有抑制間皮細胞生長、促進其凋亡作用。流式細胞儀檢測繼而發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡率在胃癌上清作用前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，說明間皮細胞凋亡在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中廣泛存在。Hoechst 33258熒光染色從形態(tài)學(xué)顯示，胃癌上清作用后間皮細胞出現(xiàn)典型凋亡特征，如核固縮、核溶解、核碎裂，甚至細胞大片缺失，出現(xiàn)“真空區(qū)”。

黃芪有對抗毒素B1誘發(fā)癌變的作用，可增加環(huán)磷酰胺CTX抗癌活性，并促進因CTX所致機體造血功能損傷的恢復(fù)。黃芪總黃酮TFA可降解細胞脂質(zhì)過氧化物生成，阻斷自由基的鏈式反應(yīng)，防止細胞損傷和致突變，從而發(fā)揮抗癌作用。王曉瑜等［8］報道，黃芪提取液可通過調(diào)節(jié)花生四烯酸系統(tǒng)的代謝而誘導(dǎo)腫瘤細胞周期停滯，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成，防御腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性等機制發(fā)揮其抗腫瘤作用?；谝陨侠碚摚狙芯繉ⅫS芪提取液與胃癌上清共培養(yǎng)，作用于間皮細胞，觀察其通過抑制胃癌細胞作用而對間皮細胞的保護作用。

光鏡觀察到黃芪提取物與胃癌細胞上清共同作用間皮細胞后，間皮細胞體積比正常間皮細胞稍變小，形態(tài)規(guī)則，細胞連接比較緊密，少量細胞缺失，但未出現(xiàn)大面積脫落區(qū)，比胃癌上清作用組改善明顯。MTT實驗中，胃癌上清組與間皮細胞組存活率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明黃芪可抑制胃癌細胞對間皮細胞的破壞，起到保護作用。流式細胞檢測中，胃癌上清組及共培養(yǎng)組24、48 h凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。說明黃芪可保護間皮細胞呈時間依賴性。共培養(yǎng)組未出現(xiàn)特征性凋亡改變，只是細胞數(shù)較正常組稍減少，但未見裸露區(qū)，從形態(tài)學(xué)直觀說明黃芪具有抑制腫瘤的促凋亡作用，為臨床用藥提供依據(jù)。本研究首次證明黃芪能夠保護腹膜間皮細胞，間接證明其具有抑制胃癌細胞的促凋亡作用，在未來胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的治療與預(yù)防中應(yīng)用前景廣闊，其作用機制尚待進一步研究。

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