吳正潔， 王 成， 林正春

(1.北京理工大學(xué)珠海學(xué)院化工與材料學(xué)院，廣東珠海519088;2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院計算機科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510225;3.佛山市技術(shù)標準研究院，廣東佛山528000)

拉曼光譜是研究化合物分子受光照射后所產(chǎn)生的拉曼散射信號，能提供分子中原子振動的信息，具有制樣簡單、分析快速、無損、水干擾小，以及所檢測的樣品僅需微量即可滿足測量要求等諸多優(yōu)點［1］.到目前為止，激光拉曼光譜分析技術(shù)多用于樣品的定性分析［2－4］，仍較少應(yīng)用于定量分析上［5－7］，已有的定量分析的研究也都存在分析精確度不高的問題［8－9］.我們曾提出以拉曼光譜中的譜強最高點作為歸一化參照的定量分析方法，并利用該方法對甲醇、乙醇進行定量分析，其相對誤差率分別為4.7%和3.5%，具有較高的定量分析精度［10－11］.本實驗將進一步拓展拉曼光譜定量分析的應(yīng)用范圍，將其用于生物樣品－血紅蛋白的定量分析上，探討拉曼光譜定量分析在生物醫(yī)學(xué)檢測上的適用性，并將對檢測分析過程的定量標準化進行討論.

1 材料與方法

1.1 人紅細胞的無菌分離

無菌抽取健康成人的靜脈血，肝素鋰抗凝，即刻以1 500 r/min速度離心10 min，去除上層血漿和脂質(zhì)體，加入3倍以上體積的細胞緩沖液，1 500 r/min的速度離心5 min，去除上清液.如此重復(fù)洗滌紅細胞3次，再將紅細胞重懸于緩沖液中.

1.2 血紅蛋白的提取

通過洗滌前面提取的正常人紅細胞、低滲使紅細胞破裂釋放血紅蛋白、高速離心去除脂質(zhì)體、凝膠過濾層析等操作收集到血紅蛋白溶液.

將提取到的血紅蛋白，用PBS緩沖液配置成5個濃度梯度:1.489 5、1.821 3、2.808 8、2.978 8、3.448 4 mmol/L(heme).

血紅蛋白濃度的測量采用氰化高鐵血紅蛋白法，該方法是國際血液學(xué)標準化委員會及世界衛(wèi)生組織認可的測量血紅蛋白濃度的標準方法.血紅蛋白的濃度統(tǒng)一用血紅素的摩爾濃度表示.

1.3 檢驗樣品的制備

為了檢驗血紅蛋白濃度定量分析的相對誤差，實驗配置離體血紅蛋白檢驗樣的濃度分別為:1.845 3、2.598 4、1.889 8、2.444 6、3.081 6 mmol/L.

1.4 儀器和測量條件

顯微共焦激光拉曼光譜儀為JY LabRam INV，實驗測定條件設(shè)置為60倍物鏡、200 μm共焦孔徑.照射的激光功率選擇1.5 mW，以保證激光不會對蛋白產(chǎn)生光致?lián)p傷［12］.測量波譜范圍:600～1 800 cm－1;波數(shù)分辨率為1～2 cm－1;信號采集的曝光時間5 s.對儀器波數(shù)及激光功率的校準均采用標準硅片進行.

1.5 實驗方法

將血紅蛋白置于玻片上，采集拉曼譜.血紅蛋白樣品每個樣品測量5次，對各個拉曼譜進行去噪、去背景、基線校準后，取其平均譜.

實驗選取每組該物質(zhì)最高濃度下拉曼譜中譜強最高點作為此組所有數(shù)據(jù)歸一化的參照，對血紅蛋白的拉曼譜進行歸一化處理［10－11］.

選取血紅蛋白的 4 個特征譜峰［13－15］，1 356、1 471、1 546、1 608 cm－1，分別對這 4 個特征峰的峰強與血紅蛋白濃度作線性回歸分析，獲得各自的線性回歸方程.對比分析中采用各線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R和決定系數(shù)R2值，以及檢驗樣在各線性回歸方程下的平均相對誤差評價各回歸方程的優(yōu)劣.從實驗結(jié)果分析，拉曼特征峰的峰強與血紅蛋白濃度在1.45～3.5 mmol/L有很好的線性相關(guān)，按3倍標準偏差時的檢出限為0.461%.

2 結(jié)果與分析

波數(shù)軸的校準采用標準硅片進行，即每次測量樣品之前，將硅片特征峰校準至520.7 cm－1，如圖1所示.

圖1 校準前后標準硅片的特征峰圖Fig.1 Calibration of wave number from 519.6 cm－1to 520.7 cm－1by the silicon

儀器激光功率的穩(wěn)定性通過檢測標準樣品(如標準硅片)的特征峰強度來衡量判斷.通過測量單位時間內(nèi)標準硅片特征峰強度的變化曲線能更直觀地反映出拉曼光譜定量分析的準確性.

圖2示出標準硅片的特征峰強度隨時間的變化值，從圖中可見，在1 h內(nèi)，標準硅片的特征峰強度在116.38±1.19波動，變異系數(shù)CV為1.02%，數(shù)據(jù)波動范圍小，激光功率穩(wěn)定性優(yōu)，適用于對檢測樣品進行拉曼光譜定量分析.

圖2 0～1 h內(nèi)測出的標準硅片的特征峰(520.7 cm－1)強度變化曲線Fig.2 The intensity of silicon Raman band at 520.7 cm －1(S)as function of time

拉曼儀經(jīng)波束軸和激光功率的校準之后，可直接用于血紅蛋白樣品的檢測.血紅蛋白的拉曼原始譜圖經(jīng)去噪、去背景、基線校準之后得到拉曼處理譜圖，再經(jīng)前述歸一化方法處理后，得到血紅蛋白的拉曼結(jié)果譜圖，如圖3所示，血紅蛋白濃度從下到上分別為 1.489 5、1.821 3、2.808 8 mmol/L(heme).該譜圖中譜峰的相關(guān)數(shù)據(jù)，如譜峰強度等可直接用做定量分析.

圖3 經(jīng)去噪、去背景、基線校準、歸一化處理后的血紅蛋白拉曼譜圖Fig.3 Raman spectra of hemoglobin obtained by denoising，removing the background，normalization and baseline correction

實驗選取血紅蛋白的4個特征譜峰，1 356、1 471、1 546、1 608 cm－1，獲得譜強與血紅蛋白濃度的線性回歸方程，如表1所示.從所建立的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R和決定系數(shù)R2值上看，1 546 cm－1處的線性相關(guān)最優(yōu).

表1 譜峰與濃度間的線性回歸方程及其線性相關(guān)Table 1 Results of the function relation and the linear correlation between intensity of Raman bands and hemoglobin concentration

利用上述4個譜帶所獲取的線性回歸方程，對不同濃度的血紅蛋白樣品進行檢驗分析，各個檢驗樣定量分析結(jié)果的相對誤差如表2所示.

從表2中可以看出，利用上述4個譜帶建立的線性回歸方程計算出的檢驗樣品的相對誤差率，除1 471 cm－1譜帶的相對誤差波動較大外，其他3個譜帶的相對誤差波動較小，且平均相對誤差率均在0.058 7 ～0.094 3.說明利用 1 356、1 546、1 608 cm－1譜峰做血紅蛋白濃度的定量分析都是可行的，分析結(jié)果的精確率較高.

表2 離體血紅蛋白檢驗樣的平均相對誤差Table 2 The average relative error of tested hemoglobin

將1 356、1 471、1 546、1 608 cm－14 個譜峰分別應(yīng)用于定量分析后出現(xiàn)的不同結(jié)果可能與其本身譜線的歸屬性質(zhì)有關(guān)，其歸屬類型如表3所示.1 356 cm－1歸屬于去氧血紅蛋白的特征譜線，隸屬ν4，是吡咯半環(huán)對稱振動.該譜帶在514 nm激發(fā)光下處于明顯的共振模式，是血紅蛋白所有特征譜線中信號最強，最不易受噪聲干擾的譜帶，穩(wěn)定性高.但該譜帶對卟啉環(huán)上π－π*的躍遷非常敏感，對血紅素的氧合狀態(tài)也非常敏感，被稱為其氧化標記帶［13－14］.血紅蛋白與氧結(jié)合后，該譜帶移至1 371 cm－1處.故選擇ν4譜線做定量分析時，只要確保血紅蛋白完全處于去氧態(tài)或氧合態(tài)(處于氧合態(tài)時，可利用1 371 cm－1譜線做定量分析)，不存在既有氧合態(tài)又有去氧態(tài)的情況，便可利用本實驗提出的歸一化方法快速、準確地對血紅蛋白濃度進行測定分析.而判定血紅蛋白是否完全處于去氧態(tài)或氧合態(tài)，則僅需觀察血紅蛋白拉曼譜是否只出現(xiàn)1 356 cm－1譜帶或只出現(xiàn)1 371 cm－1譜帶.若兩者同時出現(xiàn)，則說明血紅蛋白處于氧合態(tài)－去氧態(tài)的轉(zhuǎn)換過程中，此時采集的譜線，利用本實驗采用的歸一化方法做定量分析的準確度會受到影響，相對誤差高.一般而言，不建議采用去氧態(tài)和氧合態(tài)共存的血紅蛋白拉曼譜線做定量分析，若采集到的拉曼譜中兩種譜線都存在，則建議選擇兩個譜帶間譜區(qū)域的強度和做比值參照，這樣對改善該譜線定量分析結(jié)果的精確度會有所幫助.

表3 特征譜線的歸屬［13－15］Table 3 The assignment of Raman bands for hemoglobin

1 546、1 608 cm－1譜帶分別歸屬于 ν(CβCβ)振動模式和ν(CαCm)不對稱振動模式，當(dāng)使用這兩個譜帶做定量分析時，同樣受到血紅蛋白所處分子構(gòu)象(氧合態(tài)和去氧態(tài))的影響.1 608 cm－1譜帶屬于去氧血紅蛋白的特征譜線，當(dāng)血紅蛋白結(jié)合氧后，該譜帶消失，產(chǎn)生位于1 638 cm－1屬于υ10模式的譜線.血紅蛋白結(jié)合了少量的氧，但還沒有轉(zhuǎn)變到氧合態(tài)時，1 608 cm－1譜帶出現(xiàn)了強度降低，而1 638 cm－1強度升高.這時采用任一個譜帶做定量分析都是不準確的.所以，同1 356 cm－1譜帶一樣，只能采用血紅蛋白完全處于去氧態(tài)或氧合態(tài)時的拉曼譜圖做定量分析.選用1 546 cm－1譜帶做定量分析的前提條件與 1 356、1 638 cm－1相同.

1 471 cm－1譜帶表征－CH2的振動模式，對血紅素的氧合狀態(tài)不敏感.選擇該譜帶作為代表，目的是討論采用對血紅蛋白變化不敏感的特征譜帶做血紅蛋白濃度定量分析的可行性.從表2的結(jié)果上看，該譜帶用于定量分析時，雖然有部分檢驗樣得出的相對誤差較小，準確性較高，但是不同檢驗樣檢測結(jié)果的準確率不穩(wěn)定，波動較大，相對誤差在0.038 3～0.376 0變動，說明采用該譜帶做定量分析，定量結(jié)果的隨機性較高，結(jié)果的準確性難以保證，該方案可行性不高.

綜上所述，對血紅蛋白采用本實驗發(fā)展的歸一化方法進行拉曼光譜定量分析，在判定血紅蛋白完全處于去氧態(tài)或氧合態(tài)后，選取ν4譜帶如去氧合態(tài)的1 356 cm－1譜帶做定量分析的相對誤差最小，僅為0.058 7.

3 結(jié)論

本實驗結(jié)合歸一化方法，利用優(yōu)化的定量分析技術(shù)，對血紅蛋白的濃度進行定量分析，分析結(jié)果表明，利用該方法可以對離體血紅蛋白進行無損、簡單、快速、精確的定量分析.開創(chuàng)了拉曼光譜定量分析在生物樣品上的應(yīng)用，拓展了拉曼光譜的應(yīng)用領(lǐng)域.特別是，實現(xiàn)了對生物樣品的無創(chuàng)性定量檢測，有力地推動發(fā)展了生物樣品的無損測量技術(shù).

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