彭敏燕， 梁旭方， 方 榮， 于海靜， 朱 滔

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)系，廣東廣州510632)

翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)隸屬于鱸形目(Perciformes)、暖鱸科(Percichthyidae)、鱖屬，俗稱(chēng)桂魚(yú)、桂花魚(yú)、胖鱖、季花魚(yú)等，是淡水底棲的肉食性魚(yú)類(lèi).它具有體型大，生長(zhǎng)快，味道鮮美等特點(diǎn)，深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)，有“淡水石斑魚(yú)”之稱(chēng).目前，人工養(yǎng)殖的鱖魚(yú)主要是翹嘴鱖和大眼鱖，翹嘴鱖養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，已經(jīng)成為我國(guó)重要的名貴經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，因而具有很大商業(yè)養(yǎng)殖價(jià)值［1］.淀粉酶(amylase，AMY)是一種消化酶，主要分布在翹嘴鱖的腸道和胰臟中［2］，它能水解食物中的淀粉形成二糖和三糖，再由其他酶轉(zhuǎn)化成能量以供魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)代謝［3］.不過(guò)魚(yú)類(lèi)本身分泌的AMY等消化酶還不能夠滿(mǎn)足其快速生長(zhǎng)發(fā)育的需要，養(yǎng)殖中需要在飼料中額外添加適量外源酶來(lái)彌補(bǔ)內(nèi)源酶的不足，以提高飼料的利用率并促進(jìn)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)［4］.因此，從分子水平上對(duì)AMY基因進(jìn)行研究，對(duì)促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中翹嘴鱖的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的意義.

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是廣泛存在于基因組中的一類(lèi)由單個(gè)堿基轉(zhuǎn)換或顛換引起的 DNA序列變異，除了密度高、遺傳穩(wěn)定的特點(diǎn)外，更重要的是某些位于基因內(nèi)部的SNP有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平［5］.微衛(wèi)星 (microsatellite)又稱(chēng)簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simplesequencerepeats，SSR)，是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(一般為1～6個(gè))為重復(fù)單位組成的簡(jiǎn)單多次串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛存在于各類(lèi)真核基因組中，它具有多態(tài)性高、結(jié)果穩(wěn)定可靠等特點(diǎn).因此，它和SNP標(biāo)記都是十分理想的分子標(biāo)記，在遺傳圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)定位、標(biāo)記輔助選擇、遺傳多樣性評(píng)估等領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用價(jià)值［6］.例如 Dickey等［7］發(fā)現(xiàn)果蠅AMY調(diào)控基因的多態(tài)性位點(diǎn)影響了果蠅淀粉酶的分泌水平;豬ATF4基因的SNP位點(diǎn)A159G對(duì)臀部膘厚有極顯著影響［8］.此外，呂偉華等［9］采用23對(duì)微衛(wèi)星分別標(biāo)記了鯉魚(yú)的體長(zhǎng)、體高、體厚和體質(zhì)量4種經(jīng)濟(jì)性狀;林琳等［10］在中國(guó)人群中對(duì)妊高癥相關(guān)基因eNOS內(nèi)含子13進(jìn)行了微衛(wèi)星標(biāo)記.目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)養(yǎng)殖業(yè)動(dòng)物AMY基因多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)的報(bào)道中，常見(jiàn)的有家畜、貝類(lèi)、甲殼類(lèi)以及一些經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)等［11－13］，而關(guān)于翹嘴鱖AMY基因SNP及微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)的研究則尚未見(jiàn)報(bào)道.因此，本研究試圖初步對(duì)影響生長(zhǎng)發(fā)育有的AMY進(jìn)行SNP和微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)，為后期進(jìn)行翹嘴鱖的分子遺傳育種提供理論依據(jù).實(shí)驗(yàn)首先對(duì)翹嘴鱖AMY基因組序列進(jìn)行DNA測(cè)序，初步檢測(cè)出SNPs和微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)，并通過(guò)CRS-PCR和PCR-DS法對(duì)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證和分型，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測(cè)微衛(wèi)星多態(tài)性.以期為今后研究翹嘴鱖AMY基因的結(jié)構(gòu)和功能提供分子標(biāo)記，以及從分子水平上為后期探索AMY基因的多態(tài)性與翹嘴鱖生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系奠定其理論基礎(chǔ)，有利于加快翹嘴鱖遺傳選育進(jìn)程.

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實(shí)驗(yàn)材料 翹嘴鱖購(gòu)于廣東佛山新榮魚(yú)苗繁殖場(chǎng)，全部系人工繁育苗種，其親魚(yú)均源自長(zhǎng)江水系，實(shí)驗(yàn)用魚(yú)共166尾.以鯪魚(yú)苗作為餌料魚(yú)，大小要適口.

(2)主要試劑 TIANGEN DNA提取試劑盒為合達(dá)公司(廣州)產(chǎn)品，TaqTM DNA聚合酶和限制性?xún)?nèi)切酶為寶生物工程(大連)有限公司(TAKARA)產(chǎn)品，其他試劑均為進(jìn)口分裝或者國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

(3)引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室提供的鱖魚(yú)AMY基因組序列(GenBank登陸號(hào):EU9028272)，用軟件Primer Premier 5和Primer 1.0綜合分析，設(shè)計(jì)5對(duì)引物(P1-P5)用于翹嘴鱖AMY基因SNPs位點(diǎn)的檢測(cè).引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物信息如表1.

表1 翹嘴鱖AMY基因各引物信息Table 1 Primers information of AMY gene in Siniperca chuatsi s

1.2 方法

(1)基因組DNA提取 獲取實(shí)驗(yàn)魚(yú)的鰭條組織，按TIANGEN DNA提取試劑盒推薦方法提取基因組DNA.

(2)PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化測(cè)序 隨機(jī)選取翹嘴鱖DNA模板20個(gè)，分別用5對(duì)引物(P1－P5)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系:10×buffer緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，rTaq 酶 0.125 μL，模板 1 μL，引物各加 0.5 μL，最后補(bǔ)充雙蒸水(ddH2O)至 25 μL.PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，根據(jù)不同引物的退火溫度進(jìn)行退火1 min，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃下延伸5 min.PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成.

(3)SNPs位點(diǎn)的篩選和分型 應(yīng)用序列分析軟件Clustal X，DNAStar和Chromas綜合分析測(cè)序結(jié)果，篩選出AMY基因中的SNP位點(diǎn)，然后采用CRSPCR法對(duì)部分SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型［14］.使用在線錯(cuò)配引物設(shè)計(jì)軟件 dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)設(shè)計(jì)錯(cuò)配引物 P6(見(jiàn)表1)，然后使用引物P6擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，使產(chǎn)物中的SNP位點(diǎn)A1可被TaqI酶切.酶切體系:TaqI 0.5 μL，BSA 1.0 μL，Buffer 1.0 μL，PCR 產(chǎn)物 0.4 μL，最后補(bǔ)充雙蒸水至10 μL.酶切產(chǎn)物使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的聚丙烯酰胺凝膠(VAcr∶VBis=29∶1)進(jìn)行電泳，120 V電壓電泳4 h后銀染顯色.另外，對(duì)不能使用CRS-PCR法的SNPs位點(diǎn) A2、A3和 A4采用 PCRDS法進(jìn)行分型.

(4)微衛(wèi)星位點(diǎn)的檢測(cè)及分型 使用SSRHunter 1.03搜索鱖魚(yú)AMY基因組的微衛(wèi)星序列，并設(shè)計(jì)特異引物P7(見(jiàn)表1).擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的聚丙烯酰胺凝膠中用120 V電壓電泳4 h，銀染顯色.

(5)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)各SNPs和微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型，采用遺傳多樣性分析軟件(PopGene 32)和多態(tài)信息含量計(jì)算軟件(PIC-Calc 0.6)計(jì)算翹嘴鱖的遺傳多樣性指標(biāo).

2 結(jié)果與分析

2.1 翹嘴鱖AMY基因SNPs位點(diǎn)的測(cè)序及酶切結(jié)果

對(duì)翹嘴鱖AMY基因P1-P5的PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNPs位點(diǎn).在第1內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)了一個(gè)C/G的突變位點(diǎn)A1;在第5內(nèi)含子處發(fā)現(xiàn)了3個(gè) SNPs位點(diǎn)，分別命名為 A2、A3和A4.A2位點(diǎn)發(fā)生了T/A突變，A3發(fā)生了A/T突變，A4發(fā)生了G/C突變.

圖1 翹嘴鱖AMY基因A1、A2、A3和A4 4個(gè)SNPs位點(diǎn)的測(cè)序峰圖(箭頭表示突變發(fā)生的位置)Fig.1 Sequencing pictures of four SNPs A1，A2，A3 and A4 of AMY gene in Siniperca chuatsi(Arrows show the positions of variation)

圖2 翹嘴鱖AMY基因SNP位點(diǎn)A1酶切電泳圖Fig.2 CRS-PCR picture of SNP locus A1 of AMY gene in Siniperca chuatsi

采用CRS-PCR方法對(duì)A1位點(diǎn)分型，結(jié)果共檢測(cè)到3種基因型，分別為 GG(205 bp、21 bp)、GC(226 bp、205 bp、21 bp)和 CC(226 bp)，21 bp 的電泳帶太小沒(méi)有在電泳圖中顯示出來(lái)，A1測(cè)序峰圖和酶切圖分別見(jiàn)圖1和圖2.由于A2、A3和A4 3個(gè)SNPs位點(diǎn)兩邊的序列不適合設(shè)計(jì)酶切引物，因此無(wú)法采用酶切的方法進(jìn)行分型，實(shí)驗(yàn)將部分模板使用PCR-DS法分型.測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)A2位點(diǎn)有兩種基因型，分別為AT和TT;A3位點(diǎn)有3種基因型，分別為AA、AT和TT;A4位點(diǎn)也有3種基因型，分別是AA、AG和GG.這3個(gè)SNPs位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果如圖1.

2.2 翹嘴鱖AMY基因SNPs位點(diǎn)的基因頻率、基因型頻率及遺傳多態(tài)信息分析

統(tǒng)計(jì)翹嘴鱖AMY基因4個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型和基因頻率，詳見(jiàn)表2.卡方分析表明，4個(gè)SNPs位點(diǎn)P值均大于0.05，說(shuō)明基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡.當(dāng)PIC＞0.5為高度多態(tài)性，0.25＜PIC＜0.5為中度多態(tài)性，PIC＜0.25為低度多態(tài)性.由表2可知，AMY基因的4個(gè)SNPs位點(diǎn)均為中度多態(tài)性.各位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)與等位基因的絕對(duì)值接近，說(shuō)明等位基因在兩個(gè)群體中的分布均勻;且雜合度為0.345 7－0.492 0，顯示了較好的遺傳多態(tài)性.

表2 翹嘴鱖AMY基因4個(gè)SNPs位點(diǎn)的遺傳多態(tài)信息Table 2 Genetic information of four SNPs locus of AMY gene in Siniperca chuatsi

2.3 翹嘴鱖AMY基因微衛(wèi)星位點(diǎn)B1的分型與遺傳多態(tài)性分析

從翹嘴鱖AMY基因組序列第5內(nèi)含子中檢測(cè)到一個(gè)重復(fù)序列為(TTA)18(TAA)18的微衛(wèi)星座位B1，將該位點(diǎn)通過(guò)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果呈多態(tài)性(如圖3).結(jié)合微衛(wèi)星位點(diǎn)B1的測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)有4個(gè)等位基因，微衛(wèi)星等位基因大小分別為 96、99、102、105 bp，共組成 9 種單倍型.由表3可知，在翹嘴鱖群體中B1位點(diǎn)的雜合度為0.705 5，且多態(tài)信息含量大于0.5，說(shuō)明翹嘴鱖兩個(gè)群體遺傳多樣性非常豐富，具有高度多態(tài)性.

圖3 翹嘴鱖AMY基因微衛(wèi)星位點(diǎn)B1的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.3 PAGE picture of SSR locus B1 of AMY gene in Siniperca chuatsi

表3 翹嘴鱖AMY基因微衛(wèi)星位點(diǎn)B1在翹嘴鱖群體中的遺傳多態(tài)信息Table 3 Genetic information of SSR locus B1 of AMY gene in Siniperca chuatsi

3 討論

AMY在許多水生動(dòng)物中控制著碳水化合物的代謝，并且是影響身體生長(zhǎng)的主要因素之一［15］，因此本實(shí)驗(yàn)選擇AMY基因作為候選基因進(jìn)行研究，尋找可能影響翹嘴鱖生長(zhǎng)的多態(tài)性位點(diǎn).實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)翹嘴鱖AMY基因具有兩種分子標(biāo)記，其中包括4個(gè)SNPs位點(diǎn)和一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn).SNPs位點(diǎn)中除了A2只有兩種基因型外，其余3個(gè)SNPs位點(diǎn)均為3種基因型，而微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型B1多達(dá)9種.由此可見(jiàn)AMY基因的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量豐富.

衡量一個(gè)群體的遺傳多態(tài)性一般是通過(guò)計(jì)算其多態(tài)信息含量和各位點(diǎn)的平均雜合度來(lái)實(shí)現(xiàn)的［16］.多態(tài)信息含量(PIC)是衡量等位基因片段多態(tài)性的指標(biāo).當(dāng)PIC≥0.5時(shí)，為高度多態(tài)性;當(dāng)0.25≤PIC＜0.5時(shí)，為中度多態(tài)性;當(dāng)PIC＜0.5時(shí)，為低度多態(tài)性.在翹嘴鱖群體中，AMY基因4個(gè)SNPs位點(diǎn)的PIC值為0.284 3－0.371 4，為中度多態(tài)性;而微衛(wèi)星位點(diǎn)B1在翹嘴鱖群體中的PIC值是0.650 4，屬于高度多態(tài)性.在一個(gè)群體中，多態(tài)信息含量越大，表明該位點(diǎn)雜合子比例越大，提供的遺傳信息越多.群體的雜合度(H)反映了被檢測(cè)位點(diǎn)上群體的雜合子的頻率，是群體遺傳變異的一個(gè)最適參數(shù)，雜合度越高，群體的遺傳多樣性越豐富.從表中2和表3的雜合度數(shù)值可以看出，翹嘴鱖 AMY基因的4個(gè)SNPs位點(diǎn)均呈中度遺傳多樣性，而微衛(wèi)星位點(diǎn)B1具有高度的群體多樣性，群體遺傳結(jié)構(gòu)良好.有效等位基因數(shù)(Ne)是基因純合度的倒數(shù)，是反映群體遺傳變異大小的一個(gè)指標(biāo)，其數(shù)值越接近所檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)值，說(shuō)明等位基因在群體中的分布越均勻［17］.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，翹嘴鱖AMY基因4個(gè)SNPs位點(diǎn)和微衛(wèi)星位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)均接近等位基因的絕對(duì)值，表明各等位基因均勻分布于翹嘴鱖群體中.

翹嘴鱖AMY基因中共檢測(cè)到4個(gè)SNPs和一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，各多態(tài)位點(diǎn)在群體中表現(xiàn)出了豐富的遺傳多態(tài)性.因此，本研究的5個(gè)多態(tài)性分子標(biāo)記為后期研究翹嘴鱖的生長(zhǎng)發(fā)育提供了理論基礎(chǔ)，對(duì)加速翹嘴鱖分子標(biāo)記輔助育種的進(jìn)程具有重要意義.

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