張克維，張 麟，柴躍生

（1.太原科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，太原 030024；2.奧本大學(xué)材料研究與教育中心，美國(guó) 奧本 36849）

目前，國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)高度重視對(duì)磁致伸縮生物傳感器在各種病菌檢測(cè)中的應(yīng)用研究［1-3］。磁致伸縮生物傳感器由于其低成本、高靈敏度、操作簡(jiǎn)便、無(wú)線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，引起了研究者極大的興趣。其工作原理是利用磁致伸縮材料的磁致伸縮效應(yīng)。當(dāng)磁致伸縮材料在外磁場(chǎng)下，它的尺寸會(huì)發(fā)生改變。如果磁致伸縮材料被置于交變磁場(chǎng)中，則會(huì)發(fā)生受迫振動(dòng)。磁致伸縮彈性桿的無(wú)阻尼縱向受迫振動(dòng)方程為［4］:

式中c:彈性縱波沿桿縱向傳播速度，f:單位長(zhǎng)度上的均勻分布的激振外力，u:縱向位移，ρ:密度，A:桿橫截面積。

一端固定、一端自由，長(zhǎng)為L(zhǎng)的彈性桿自由振動(dòng)的諧振頻率可表示為:

上式所定義的諧振頻率忽略了磁致伸縮彈性桿材料泊松比的影響，但是由于磁致伸縮生物傳感器用于檢測(cè)微量細(xì)菌，對(duì)于磁致伸縮彈性桿自由振動(dòng)的諧振頻率的精度高度敏感［5］。對(duì)于矩形截面磁致伸縮彈性桿在考慮到泊松比的影響后，其自由振動(dòng)的諧振頻率可表示為:

式中，L:磁致伸縮生物傳感器的半長(zhǎng)度（兩端自由的磁致伸縮生物傳感器在交變磁場(chǎng)中振動(dòng)時(shí)，沿長(zhǎng)度的中間點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)處視為固定端），fn:第n 階模態(tài)頻率，E:楊氏模量，ρ:密度，μ:泊松比，α:磁致伸縮生物傳感器諧振頻率修正系數(shù)，可表示為:

當(dāng)磁致伸縮彈性桿的力學(xué)特性或表面質(zhì)量載荷發(fā)生變化時(shí)，其諧振頻率也會(huì)相應(yīng)的改變。如果一個(gè)質(zhì)量為m（m＜＜M）的載荷被均勻地加載到磁致伸縮彈性桿表面，其諧振頻率的漂移量（△f）可用下式表示:

式中，M是無(wú)載荷時(shí)磁致伸縮彈性桿的質(zhì)量。

諧振頻率可以作為磁致伸縮生物傳感器的輸出信號(hào)。磁致伸縮彈性桿表面加載生物識(shí)別體（如:抗體）后，與待測(cè)物（如:病菌）發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)，磁致伸縮生物傳感器表面質(zhì)量載荷增加，導(dǎo)致其諧振頻率發(fā)生漂移。而頻率漂移量與待測(cè)物的濃度成正比。因此，通過(guò)檢測(cè)其諧振頻率的漂移量便可計(jì)算出待測(cè)物的濃度。然而，病菌與生物傳感器表面的非特異性結(jié)合是影響傳感器性能一個(gè)非常重要的因素。有些病菌非特異性能力強(qiáng)，此時(shí)往往需要阻斷劑來(lái)阻止病菌的非特異性結(jié)合。通過(guò)使用阻斷劑可以阻止病菌與傳感器表面之間的非特異性結(jié)合，提高傳感器的專一性及可靠性，如圖所示。

圖1 阻斷劑阻止病菌與傳感器表面非特異性結(jié)合示意圖Fig.1 Illustration of immobilization of blocking agents for preventing nonspecific binding of bacteria

由于酪蛋白和牛血清白蛋白具有良好的穩(wěn)定性，同時(shí)不與大多數(shù)生物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，作為阻斷劑已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于 ELISA和其他實(shí)驗(yàn)中［6-7］。另外，酪蛋白和牛血清白蛋白分子量較小，理論上有更大的幾率占據(jù)生物抗體之間的空位。因此，在這項(xiàng)研究中，以李斯特菌為目標(biāo)病菌，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究酪蛋白和牛血清白蛋白對(duì)李斯特菌與磁致伸縮生物傳感器表面之間非特異性結(jié)合的阻斷效率。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 傳感器制備

磁致伸縮生物傳感器所使用的材料是從美國(guó)Honeywell International公司購(gòu)買的磁致伸縮薄膜MetglasTM2826 MB（鐵鎳合金），厚度為 30 μm.為了提高傳感器的質(zhì)量靈敏度，首先用#2000的砂紙使薄膜磨到15 μm厚。然后，用高精度切割機(jī)把薄膜切割成尺寸為1.0 mm×0.3 mm長(zhǎng)方條。之后，放入甲醇中用超聲波清洗30 min，再用氮?dú)獯蹈?。最后，用磁控濺射儀先在薄膜上下兩個(gè)表面濺射一層厚度為100 nm的Cr，再濺射一層厚度為125 nm的Au.其中，Cr鍍層用來(lái)增強(qiáng)磁致伸縮材料和Au鍍層之間的結(jié)合力，而Au鍍層則是用于固定抗體，同時(shí)也可以保護(hù)磁致伸縮材料不被腐蝕。這些磁致伸縮長(zhǎng)方條即為磁致伸縮生物傳感器的基體，用于抗體和阻斷劑的生物加載。

1.2 生物抗體加載

單克隆抗體C11E9溶液在蒸餾水中稀釋成濃度為1.05×1012viron/ml的溶液。為了使抗體更牢固的固定在上述Cr/Au傳感器表面，對(duì)抗體改性后與傳感器表面的Au鍍層通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合在一起［8］。

1.3 阻斷劑加載

酪蛋白和牛血清白蛋白粉末分別在磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋并配成5%wt和3%wt的溶液，把Cr/Au傳感器放入5%wt的酪蛋白或者3%wt牛血清白蛋白溶液中并旋轉(zhuǎn)1 h，使阻斷劑酪蛋白或者牛血清白蛋白顆粒附著在傳感器表面。為了分析阻斷劑對(duì)傳感器性能的影響，使用了四種不同的處理方式，如表1所示。

表1 磁致伸縮傳感器生物加載情況Tab.1 Different immobilization conditions of magnetostrictive biosensors

1.4 李斯特菌準(zhǔn)備

使用濃度為5×108cfu/ml李斯特菌溶液。將李斯特菌溶液依次用蒸餾水稀釋成溶度為5×107cfu/ml，5 ×106cfu/ml…5 ×101cfu/ml的溶液。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

磁致伸縮生物傳感器系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備如圖2所示。

圖2 磁致伸縮生物傳感器系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.2 Schematic illustration of experiment setup for a magnetostrictive biosensor system

該實(shí)驗(yàn)設(shè)備包括:一個(gè)繞有銅線圈的測(cè)試腔、一個(gè)蠕動(dòng)泵、兩個(gè)病菌存儲(chǔ)器、一個(gè)永磁鐵、一個(gè)矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀以及一臺(tái)電腦。測(cè)試時(shí)，磁致伸縮生物傳感器被放入測(cè)試腔內(nèi)。矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀（HP 87511）用于提供交流電并通過(guò)掃頻檢測(cè)磁致伸縮傳感器的諧振信號(hào)。線圈把交流電轉(zhuǎn)換成交變磁場(chǎng)并激勵(lì)磁致伸縮傳感器振動(dòng)。電腦通過(guò)控制矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄傳感器的諧振頻率。永磁鐵用來(lái)提供一個(gè)偏置磁場(chǎng)，通過(guò)調(diào)節(jié)永磁體與傳感器位置使諧振信號(hào)最優(yōu)化。測(cè)試時(shí)，將磁致伸縮生物傳感器放入測(cè)試腔內(nèi)，用蠕動(dòng)泵使蒸餾水以30 μl/min的流速通過(guò)測(cè)試腔直到傳感器的諧振頻率在水中達(dá)到穩(wěn)定并保持20 min.該頻率則作為初始參考頻率。然后，使不同濃度（即5×101cfu/ml，5×102cfu/ml…to 5 ×108cfu/ml）的李斯特菌以相同的流速流過(guò)測(cè)試腔。每個(gè)濃度的溶液流過(guò)的時(shí)間為20 min，每隔30 s記錄一次諧振頻率。實(shí)驗(yàn)完成后，傳感器在蒸餾水中侵潤(rùn)3次后在空氣中干燥，并對(duì)其表面進(jìn)行SEM觀察。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

不同處理?xiàng)l件的磁致伸縮生物傳感器對(duì)李斯特菌檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。圖中，每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都是2個(gè)相同尺寸的傳感器在相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)試結(jié)果的平均值。由圖3可以看出，在相同的李斯特菌濃度中，諧振頻率漂移量從大到小的傳感器分別是:No.1，No.2，No.3 和 No.4.由此可以推斷，No.1傳感器表面質(zhì)量載荷最大，即傳感器表面李斯特菌的數(shù)量最多。其原因是由于傳感器表面既有李斯特菌與抗體的特異性結(jié)合又有李斯特菌與傳感器表面的非特異性結(jié)合。而No.2傳感器表面只有李斯特菌的非特異性結(jié)合，而這里非特異性結(jié)合是一種隨機(jī)的物理吸附，所以No.2傳感器表面李斯特菌的數(shù)量小于No.1傳感器。No.3和No.4傳感器頻率漂移量最小而且比較相近。其原因是由于No.3和No.4傳感器表面分別被酪蛋白和牛血清白蛋顆粒覆蓋，導(dǎo)致李斯特菌難以與傳感器表面發(fā)生非特異性結(jié)合。

圖3 磁致伸縮生物傳感器諧振頻率漂移量與李斯特菌濃度的曲線關(guān)系Fig.3 Resonance frequency shift of sensor No.1-No.4 vs populations of Listeria Monocytogenes

圖4 實(shí)驗(yàn)后No.1-No.4傳感器表面的SEM圖Fig.4 The SEM images of No.1-No.4 sensor surfaces after experiments

圖4為實(shí)驗(yàn)后生物加載條件下的磁致伸縮生物傳感器表面的SEM圖。

從圖中可以看出，傳感器表面李斯特菌（黑色條狀物）數(shù)量由多到少的順序分別是:No.1，No.2，No.3和No.4傳感器，與上述檢測(cè)結(jié)果基本相符。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明:尺寸為1.0 mm×0.3 mm×15 μm的磁致伸縮生物傳感器的檢測(cè)極限是102cfu/ml.李斯特病菌與傳感器表面金鍍層的非特異性結(jié)合能力較強(qiáng)，不使用阻斷劑會(huì)影響磁致伸縮生物傳感器的專一性和可靠性。而阻斷劑酪蛋白和牛血清白蛋白均可以明顯阻止李斯特菌非特異性結(jié)合，提高磁致伸縮生物傳感器的性能。本研究結(jié)果對(duì)磁致伸縮生物傳感器的系統(tǒng)設(shè)計(jì)有重要指導(dǎo)意義。

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