趙文麟，趙文樹，黃洪偉，仲麗麗

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040;2．上海龍華醫(yī)院，上海200032;3．黑龍江省中醫(yī)研究院，黑龍江 哈爾濱150001)

《素問·保命全形論》篇載:“凡刺之真，必先治神?！薄鹅`樞·刺節(jié)真邪》亦談:“用針之類，在于調(diào)氣?！惫蕦?shí)驗(yàn)用動物采用電針“調(diào)氣”，即調(diào)節(jié)機(jī)體的氣血運(yùn)行。本實(shí)驗(yàn)觀察電針攢竹穴對骨癌痛大鼠所引起的下丘腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)中β－內(nèi)啡肽(β－Endorphin，β－EP)含量的改變，說明電針對骨癌痛的影響和調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

重70～80 g雌性Wistar大鼠1只，SD雌性大鼠40只，體重180～200 g，由山東省青島市派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。購入后適應(yīng)飼養(yǎng)1周，清潔飲水，自由攝食，每次行為實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)性訓(xùn)練，以排除應(yīng)激干擾。行為學(xué)測定時間在上午10點(diǎn)至下午2點(diǎn)之間。按隨機(jī)數(shù)字表將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、電針組，每組10只。

1．2 主要試劑與儀器

Walker256乳腺癌細(xì)胞株由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)提供，10%水合氯醛(武漢博士德生物工程有限公司)，Rabbit anti－β－EP試劑、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，JL－C2刺激器(與上海嘉龍教儀廠合作改裝)，0．22 mm×13 mm針灸針(蘇州東邦醫(yī)療器械有限公司)，YLS－3E電子壓痛儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)，YLS－6B智能熱板儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)，韓氏電針儀LD202H(北京華衛(wèi)公司)，Bx－600光學(xué)顯微鏡(上海儀圓光學(xué)儀器有限公司)，眼科手術(shù)器械、針、線、血管鉗、鑷子等。

1．3 模型制備

將1只重70～80 g雌性Wistar大鼠腹部注射入制備好的0．5 ml乳腺癌walker256細(xì)胞懸液(約2×107cells/ml)，約6～7天后，大鼠腹部明顯膨隆時，抽取大鼠腹水制成2×104cells/ml的大鼠腹水瘤細(xì)胞懸液，置于冰上保存。對模型組和電針組SD大鼠左側(cè)脛骨結(jié)節(jié)下外方與骨面呈45°朝尾側(cè)進(jìn)針，注入細(xì)胞懸液5 ul(1×105cells)，用無菌骨蠟封閉針孔。假手術(shù)組注入等量無菌生理鹽水?？瞻捉M不做處理。

1．4 治療方法

電針組在手術(shù)后8天開始治療，取“攢竹”穴，參照人體穴位骨性標(biāo)志對大鼠穴位定位，在大鼠的額骨近內(nèi)眥前1/3處，內(nèi)眶緣斜面向內(nèi)眥方向平刺5 mm，以0．22 mm×13 mm的毫針進(jìn)行針刺，雙側(cè)接電刺激器，頻率:2/100 Hz，強(qiáng)度:0．3 mA。每次留針 13 min，每日1次，連續(xù)治療6天，停1天，再連續(xù)治療6天。

1．5 行為學(xué)測定

每日觀察大鼠的皮毛、精神狀態(tài)、步態(tài)以及對食物和水的攝入量、體重等是否有改變及改變的程度變化。

1．5．1 機(jī)械性痛敏(PWT) 各組于造模前用YLS－3E電子壓痛儀測定鼠尾基礎(chǔ)機(jī)械痛閾，并于造模5天開始隔天1次測量各組大鼠鼠尾機(jī)械性痛閾。

1．5．2 熱痛敏(PWL) 各組于造模前使用YLS－6B智能熱板儀測定基礎(chǔ)熱痛閾，造模5天開始隔天1次評價大鼠對熱刺激的反應(yīng)。

1．6 免疫組化測定

1．6．1 取材及染色 造模21天行為學(xué)測定完畢后，將大鼠斷頭，冰浴條件下迅速取腦組織后行固定、石蠟包埋、切片;HE染色、常規(guī)進(jìn)行β－EP免疫組化法測定。

1．6．2 圖像分析 BX－600光學(xué)顯微鏡下觀察，每組選10張切片，每張切片選取3個視野，測量大鼠下丘腦β－EP樣陽性纖維的光密度和顆粒面積。應(yīng)用Image－Pro Plus 6．0光學(xué)分析軟件進(jìn)行分析，對不同組別下丘腦核團(tuán)β－EP陽性纖維進(jìn)行定量分析。

1．7 統(tǒng)計處理

實(shí)時定量數(shù)據(jù)用SPSS18軟件進(jìn)行分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間差異采用方差分析(ANOVA)，以P＜0．05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

大鼠于造模8天左右逐漸出現(xiàn)皮毛不亮、喜臥、不喜動，偶爾出現(xiàn)間歇性跛行，食物攝入量較空白組大鼠減少，體重增加幅度減小。

2．1 機(jī)械痛敏(PWT)

造模9天起，模型組機(jī)械性痛敏與空白組、假手術(shù)組和電針組相比有顯著性差異(P＜0．05);電針組與空白組、假手術(shù)組相比有顯著性差異(P＜0．05)。各組大鼠機(jī)械性痛敏見圖1。

2．2 熱痛敏(PWL)

造模11天起，模型組熱痛敏與空白組、假手術(shù)組和電針組相比有顯著性差異(P＜0．05);電針組與空白組、假手術(shù)組相比有顯著性差異(P＜0．05)。各組大鼠熱痛敏見圖2。

圖1 各組大鼠機(jī)械性痛敏比較

圖2 各組大鼠熱痛敏比較

2．3 β－EP免疫組化

圖4 各組大鼠β－EP免疫組化結(jié)果比較

從封三彩圖3及圖4可見各組大鼠下丘腦內(nèi)β－EP陽性纖維的密度有所不同，腦內(nèi)β－EP陽性纖維假手術(shù)組、電針組及模型組含量均高于空白組?？瞻捉M含量為0．21 ±0．05;假手術(shù)組含量為 0．37 ±0．04;電針組含量為 0．62±0．02;模型組含量為 0．69±0.03。其中模型組與空白組及假手術(shù)組比較差異性顯著(P＜0.05)，電針組與空白組及假手術(shù)組比較差異性顯著(P＜0．05);電針組與模型組比較差異性顯著(P ＜0.05)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所得行為學(xué)結(jié)果與小鼠骨癌痛時間點(diǎn)有所區(qū)別［1］。β －EP 是機(jī)體的主要的內(nèi)源性阿片肽［2］，在腦內(nèi)主要分布在下丘腦、杏仁核等部位。它的主要功能是使機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下保持平衡，主要調(diào)節(jié)疼痛、心血管和免疫功能［3］。β－EP經(jīng)下丘腦垂體門脈系統(tǒng)進(jìn)入血液中，參與體內(nèi)多種生理活動，有疼痛、免疫、應(yīng)激、抗心肌缺血［4］以及味覺嗜好［5］等。β － 內(nèi)啡肽的鎮(zhèn)痛作用較強(qiáng)，因此與鎮(zhèn)痛作用的聯(lián)系最緊密。

根據(jù)免疫組化法檢測結(jié)果推測電針可能抑制大鼠腦內(nèi)β－EP的釋放，甚至可能抑制β－EP的合成，使腦內(nèi)的β－EP樣陽性纖維的密度減低，從而減少與腦內(nèi)阿片受體的結(jié)合，以減輕癌癥骨轉(zhuǎn)移帶來的疼痛。

癌癥骨轉(zhuǎn)移給患者帶來的疼痛機(jī)制比較復(fù)雜，經(jīng)研究表明與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的β－EP含量有關(guān)。出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移疼痛時機(jī)體生理機(jī)能降低、微環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，因而出現(xiàn)各系統(tǒng)功能紊亂，β－EP在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)較為廣泛，其主要作用是針對應(yīng)激時全身各系統(tǒng)的機(jī)能協(xié)調(diào)，起到調(diào)節(jié)機(jī)體的各種生理功能的作用，但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

通過本實(shí)驗(yàn)證明2/100 Hz電針可以抑制大鼠腦內(nèi)因骨癌痛被激活的β－EP。使其與腦內(nèi)阿片受體結(jié)合產(chǎn)生作用的機(jī)會減少，從而減輕β－EP對骨癌痛的作用。

骨癌痛時機(jī)體出現(xiàn)功能紊亂，β－EP在機(jī)體內(nèi)主要作用是協(xié)調(diào)和統(tǒng)一應(yīng)激時全身各系統(tǒng)的機(jī)能，它可 以調(diào)節(jié)機(jī)體的各種生理功能。

［1］ 任炳旭，馬正良，靳艷卿，等．身痛逐瘀湯對骨癌痛小鼠痛行為及脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31(3):381－385

［2］ 韓焱晶，代偉偉，彭磊，等．針刺對應(yīng)激性胃黏膜損傷大鼠血漿和下丘腦中β－內(nèi)啡肽含量的影響［J］．針刺研究，2011，36(5):341－346

［3］ 王世英．阿片肽研究的回顧和展望［J］．生物學(xué)通報，2001，36(1):5－7

［4］ 涂乾，王華，王亞文，等．電針內(nèi)關(guān)穴后下丘腦室旁核、β－內(nèi)啡肽及白細(xì)胞介素1的變化［J］．中國臨床康復(fù)，2006，10(11):126－128

［5］ 馬雋，劉麗萍，趙毅剛，等．味覺嗜好學(xué)習(xí)對大鼠下丘腦β－內(nèi)啡肽表達(dá)及運(yùn)動行為的影響［J］．河北體育學(xué)院學(xué)報，2007，21(4):9－11