李 妍，王月華，金 宏，陳 爽，張慧鋒，趙良中，李 瑤，李文平，張 鐸，齊 玲綜述，曹慧玲審閱

(吉林醫(yī)藥學(xué)院:1.檢驗學(xué)院，2.實驗中心，3.藥學(xué)院，4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，5.科研學(xué)術(shù)處，吉林 吉林 132013)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)選擇性、高效地誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡［1］。繼重組人TRAIL蛋白(recombinate human TRAIL，rhTRAIL)、抗死亡受體5(death receptor 5，DR5)單抗進入臨床Ⅰ、Ⅱ期后，轉(zhuǎn)染TRAIL基因抗腫瘤也完成了臨床前研究，并克服了前兩種制劑半衰期短的缺點［2］。雖然多數(shù)肺腺癌(adenocarcinoma，ADC)對轉(zhuǎn)染 TRAIL基因耐藥，但TRAIL高效、低毒的優(yōu)勢推動我們不斷研究耐藥機制、探索增敏策略［3］。

1 誘騙受體導(dǎo)致TRAIL耐受

三聚體的 mTRAIL(或 sTRAIL)與 DR4、DR5在細胞膜處組裝死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(death inducing sig naling complex，DISC)，再募集、活化下游分子來傳遞凋亡信號;而誘騙受體1(decoy receptor 1，DcR1)、DcR2或骨保護素(osteoprotegerin，OPG)競爭結(jié)合TRAIL阻斷凋亡信號(圖1)［3］。以 A549為代表的DR4、DR5和 DcR1陽性 ADC對 TRAIL高度耐受［4-5］。DISC信號在胞漿內(nèi)傳遞的通路有多個環(huán)節(jié)參與TRAIL抵抗，包括c-FLIP、Bcl-2和NFκB相關(guān)的抗凋亡信號活化等，相關(guān)機制相對清晰。DcR1、DcR2對DISC組裝抑制是產(chǎn)生耐藥的上游環(huán)節(jié)，但對其影響DISC組裝、參與TRAIL抵抗的機制，尚有待深入探究。

圖1 TRAIL和TRAIL的受體

脂筏(lipid raft)是細胞膜內(nèi)富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域，可選擇性地募集磷脂酰基醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)所錨定的分子和其他類型的跨膜分子。三聚體TRAIL和三聚體DR4(DR5)結(jié)合后，被募集到脂筏內(nèi)才能組成有功能的DISC(圖2)。DcR1通過GPI錨定于細胞膜，在未結(jié)合TRAIL前已穩(wěn)定結(jié)合在脂筏中，而DR4、DR5和DcR2分布在脂筏外［6］。TRAIL與DR4結(jié)合后向脂筏內(nèi)遷移，但脂筏內(nèi)DcR1競爭結(jié)合TRAIL，并將DR4排出到脂筏外。DcR1胞漿區(qū)無“死亡結(jié)構(gòu)區(qū)域(death domain，DD)”，因此不能募集 FADD形成有功能的 DISC。DcR2可在脂外筏外可成同源三聚體，與DR4或DR5競爭結(jié)合三聚體化的TRAIL，由于胞漿區(qū)DD不完整，DcR2-TRAIL復(fù)合體可轉(zhuǎn)入脂筏但不能募集下游信號分子［7］。近年發(fā)現(xiàn)，DcR2與DR5可形成異源三聚體或多聚體，然后與TRAIL三聚體結(jié)合，(DcR2-DR5)-TRAIL復(fù)合體也轉(zhuǎn)入脂筏，但與 DcR2結(jié)合Caspase-8不能活化。(DcR2-DR5)-TRAIL因同時消耗TRAIL和caspase-8，對DR5組裝DISC形成較強的抑制效應(yīng)［7］。

圖2 TRAIL和DR4(DR5)在脂筏內(nèi)組裝DISC

2 sTRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡的活性減弱

膜型和可溶型凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL、TNF和FasL)誘導(dǎo)細胞凋亡的能力存在差異，通?？扇苄头肿诱T導(dǎo)細胞凋亡的活性弱［8-9］。FasL是TNF超家族中與TRAIL同源性最高的成員，淋巴細胞表面的mFasL主要由去整合素金屬蛋白酶10(a desintegration and metalloproteinase，ADAM10)酶切，抑制 ADAM10則減少 sFasL釋放，促進 mFas誘導(dǎo)細胞凋亡［10］。雖然活化免疫細胞釋放的sTRAIL，可結(jié)合腫瘤細胞的DR4和DR5，導(dǎo)致caspase-8活化，但其誘導(dǎo)凋亡能力弱于 mTRAIL［10］。除 mTRAIL可組裝DISC外，sTRAIL及包含了N端119～241位氨基酸的多種長度的rhTRAIL也可組裝DISC誘導(dǎo)敏感的靶細胞凋亡，但其活性也低于mTRAIL［8-9］。近年發(fā)現(xiàn)，sTRAIL和mTRAIL活性差異與細胞是否表達DcR1有密切聯(lián)系。DcR1與TRAIL結(jié)合的親和力高于 DR4，DcR1可與 DR4競爭結(jié)合 rhTRAIL或sTRAIL，阻止有 DISC組裝。即使 DR4結(jié)合的rhTRAIL遷移入脂筏內(nèi)，也可能被DcR1“搶奪”，并由DcR1將 DR4“排擠”出脂筏，研究發(fā)現(xiàn)，表型為DR4+、DR5+、DcR1+、DcR2-的 A549 細胞對 rhTRAIL高度耐受［4-5］。DcR1通過該機制對 sTRAIL和rhTRAIL抑制不僅被體外研究證實，臨床實踐中也發(fā)現(xiàn)DR4和DcR1陽性結(jié)腸癌對TRAIL誘導(dǎo)凋亡高度耐受［11］。

3 MMP-2參與mTRAIL的酶切、脫落

mTRAIL是281個氨基酸所組成Ⅱ型跨膜蛋白，分子量為32 500，其N端241個氨基酸位于胞膜外，跨膜區(qū)和胞漿區(qū)分別為26和14氨基酸［2］。病毒感染、腫瘤、自身免疫病等疾病情況下，血清中24 000 sTRAIL含量增加［12-13］。在體外以細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)及干擾素(interferons，IFNs)等刺激細胞，活化的中性粒細胞、淋巴細胞和腫瘤細胞也可釋放sTRAIL［13-16］。TRAIL 是 TNF 超家族發(fā)現(xiàn)較晚的成員，新近才證實金屬蛋白酶家族成員參與TRAIL的酶切脫落。廣譜金屬蛋白酶抑制劑1，10-菲咯啉(1，10-phenanthroline)和ADAM10抑制劑TAPI-1(tumor necrosis factor-alpha protease inhibitor-1)可顯著抑制IFN-α誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞釋放 sTRAIL，同時上調(diào)mTRAIL表達［15-16］。Secchiero等進一步證明，基質(zhì)金屬蛋白酶2(metrics metalloproteinase-2，MMP-2)也參與人 mTRAIL 的酶切，并釋放24kDa的 sTRAIL［17］。

4 跨膜分布的mTRAIL參與細胞膜脂筏形成

免疫細胞主要以內(nèi)源表達的mTRAIL殺傷腫瘤和病毒感染等靶細胞，腫瘤細胞的mTRAIL也可通過與自身或相臨細胞DR4、DR5組裝為DISC，誘導(dǎo)凋亡［16-18］。N端119～241位氨基酸是 TRAIL與受體結(jié)合的功能區(qū);其中230位Cys殘基(Cys230)參與該分子與二價鋅離子螯合，穩(wěn)定形成具有活性的同源三聚體。研究發(fā)現(xiàn)，細胞表面mTRAIL需先組裝為三聚體才能向脂筏內(nèi)遷移，而其在脂筏內(nèi)與DR5結(jié)合還參與脂筏結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，跨膜分布的mTRAIL促進細脂筏內(nèi)DISC的形成［19］。sTRAIL也具有形成DISC的功能，但sTRAIL不具備跨膜區(qū)，缺少了mTRAIL穩(wěn)定脂筏子內(nèi)DISC的功能。理論而言，抑制MMP-2對mTRAIL的酶切，可能促進mTRAIL-DR5在脂筏內(nèi)組裝DISC，從而增強凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，克服對DcR1陽性腫瘤細胞對TRAIL的耐受。

5 低濃度姜黃素對MMP-2的抑制作用

姜黃素(分子式為C21H20O6，分子量368.4)是取自姜黃屬植物根部的活性成分，具有治療炎癥、抗腫瘤和抗纖維化等藥理作用［20］。姜黃素以活性氧(reactive oxygen species，ROS)依賴途徑抑制胰腺癌、肝癌、乳腺癌和肺癌等腫瘤增殖，IC50值為 50～100 μmol/L［21］。近年來，低濃度(≤50 μmol/L)姜黃素非ROS依賴途徑抗腫瘤的機制陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)［22］。主要包括:①抑制組蛋白去乙?；?histone deacety lases，HDACs);②通過上調(diào)p21和p27表達而抑制細胞周期運行;③通過抑制NFκB而下調(diào)細胞周期素到D1(cyclin D1)和癌基因c-myc表達;④抑制磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycinm，mTOR)途徑，使其下游抗凋亡、促增殖的靶基因表達下降等。在美國，姜黃素治療胰腺癌已進入臨床Ⅱ期，其在預(yù)防結(jié)腸癌方面的研究也日益被重視。此外，姜黃素下調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的多種蛋白，包括表皮生長因子受體、血管內(nèi)皮生長因子、MMP-2、MMP-3和 MMP-9等。新近發(fā)現(xiàn)，25～50 μmol/L姜黃素可抑制肝星狀細胞株對明膠的水解，從而降低其遷徙和侵襲，即姜黃素抑制MMP-2水解細胞外膠原蛋白［23］。

目前，姜黃素是否抑制MMP-2酶切mTRAIL還未見報道。我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)，5～20 μmol/L姜黃素以非ROS依賴的方式上調(diào)mTRAIL跨膜分布，并增強A549對TRAIL基因轉(zhuǎn)染所誘導(dǎo)的凋亡。低濃度姜黃素可能通過抑制MMP-2來抑制sTRAIL釋放，促進mTRAIL跨膜分布和DISC組裝，從而增強TRAIL誘導(dǎo)DcR1陽性肺腺癌凋亡。若要闡明姜黃素抗腫瘤的新藥理作用，尚需要參照如下技術(shù)路線深入開展研究，用實驗數(shù)據(jù)回答如下問題(圖3):①低濃度姜黃素上調(diào)TRAIL跨膜分布是否與其抑制MMP-2的酶切有關(guān)?②跨膜TRAIL增加是否促進脂筏內(nèi)DISC組裝?③姜黃素與TRAIL聯(lián)合是否促進DcR1陽性肺腺癌細胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)?

圖3 研究膜型分子脫落參與肺腺癌對TRAIL耐藥的技術(shù)路線

mTRAIL和sTRAIL均可結(jié)合死亡受體，但膜結(jié)合型分子還參與脂筏內(nèi)由DR4/DR5所組裝DISC的穩(wěn)定性。因此，闡明膜結(jié)合型TRAIL脫落的機制、證實姜黃素的新藥理作用可能為提高肺腺癌對TRAIL治療的敏感性提供新策略。

［1］Taylor D J，Parsons C E，Han H，et al.Parallel screening of FDA-approved antineoplastic drugs for identifying sensitizers of TRAIL-induced apoptosis in cancer cells［J］.BMC Cancer，2011，11:470-487.

［2］Bellail A C，Qi L，Mulligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges［J］.Rev Recent Clin Trials，2009，4(1):34-41.

［3］Piras V，Hayashi K，Tomita M，et al.Enhancing apoptosis in TRAIL-resistant cancer cells using fundamental response rules［J］.Sci Rep，2011，1:144-155.

［4］Dorothee G，Vergnon I，Menez J，et al.Tumor-infiltrating CD4+T lymphocytes express APO2 ligand(APO2L)/TRAIL upon specific stimulation with autologous lung carcinoma cells:role of IFN-alpha on APO2L/TRAIL expression and-mediated cytotoxicity［J］.J Immunol，2002，169(2):809-817.

［5］Ouyang W，Yang C，Liu Y，et al.Redistribution of DR4 and DR5 in lipid rafts accounts for the sensitivity to TRAIL in NSCLC cells［J］.Int J Oncol，2011，39(6):1577-1586.

［6］Shirley S，Morizot A，Micheau O.Regulating TRAIL receptor-induced cell death at the membrane:a deadly discussion［J］.Recent Pat Anticancer Drug Discov，2011，6(3):311-323.

［7］Chen B，Ma B，Yang S，Xing X，et al.DR5 and DcR2 are expressed in human lumbar intervertebral discs［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2009，34(19):E677-E681.

［8］Ho T C，Chen S L，Shih S C，et al.Pigment epithelium-derived factor(PEDF)promotes tumor cell death by inducing macrophage membrane tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)［J］.J Biol Chem，2011，286(41):35943-35954.

［9］Wajant H，Moosmayer D，Wüest T，et al.Differential activation of TRAIL-R1 and-2 by soluble and membrane TRAIL allowsselective surface antigen-directed activation of TRAIL-R2 by a soluble TRAIL derivative［J］.Oncogene，2001，20(30):4101-4106.

［10］Schulte M，Reiss K，Lettau M，et al.ADAM10 regulates FasL cell surface expression and modulates FasL-induced cytotoxicity and activation-induced cell death［J］.Cell Death Differ，2007，14(5):1040-1049.

［11］Granci V，Bibeau F，Kramar A，et al.Prognostic significance of TRAIL-R1 and TRAIL-R3 expression in metastatic colorectal carcinomas［J］.Eur J Cancer，2008，44(15):2312-2318.

［12］Cummins N，Badley A.The TRAIL to viral pathogenesis:the good，the bad and the ugly［J］.Curr Mol Med，2009，9(4):495-505.

［13］李 妍，曹云新，張 赟，等.PMA對Jurkat細胞株中可溶型分泌和膜型TRAIL表達的調(diào)節(jié)［J］.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2005，21(3):276-279.

［14］Tecchio C，Huber V，Scapini P，et al.IFNalpha-stimulated neutrophils and monocytes release a soluble form of TNF-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL/Apo-2 ligand)displaying apoptotic activity on leukemic cells［J］.Blood，2004，103(10):3837-3844.

［15］Li Yan，Jin Boquan，Song Chaojun，et al.Metalloprotease inhibitors reducing the shedding of human TRAIL［M］.Jilin:HHBE，2011:108-111.

［16］李 妍，金伯泉.可溶型細胞因子受體產(chǎn)生機制的研究進展［J］.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28(5):551-555.

［17］Secchiero P，Gonelli A，Corallini F，et al.Metalloproteinase 2 cleaves in vitro recombinant TRAIL:potential implications for the decreased serum levels of TRAIL after acute myocardial infarction［J］.Atherosclerosis，2010，211(1):333-336.

［18］Spitzer D，McDunn J E，Plambeck-Suess S，et al.A genetically encoded multifunctional TRAIL trimer facilitates cell-specific targeting and tumor cell killing［J］.Mol Cancer Ther，2010，9(7):2142-2151.

［19］賈 衛(wèi)，莊 然，李 琦，等.凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL與細胞膜脂筏形成的關(guān)系［J］.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2005，21(1):1-5.

［20］Jutooru I，Chadalapaka G，Lei P，et al.Inhibition of NFkappaB and pancreatic cancer cell and tumor growth by curcumin is dependent on specificity protein downregulation［J］.J Biol Chem，2010，285(33):25332-25344.

［21］Fu S，Kurzrock R.Development of curcumin as an epigenetic agent［J］.Cancer，2010，116(20):4670-4676.

［22］Chen L X，He Y J，Zhao S Z，et al.Inhibition of tumor growth and vasculogenic mimicry by curcumin through down-regulation of the EphA2/PI3K/MMP pathway in a murine choroidal melanoma model［J］.Cancer Biol Ther，2011，11(2):229-235.

［23］黃建賢，朱寶和，賀 德，等.姜黃素抑制HSC-T6細胞遷徙和侵襲的機制［J］.中華肝臟病雜志，2009，17(11):835-838.