歐陽(yáng)瑾，曹志友，王新成，王冬梅，唐銳先 (吉林醫(yī)藥學(xué)院直屬醫(yī)院，吉林吉林 132013)

骨質(zhì)增生癥［1］又稱骨刺、骨關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)退行性病變，中醫(yī)辨證里屬“痹證”的范疇，近年來(lái)已成為中老年人的常見(jiàn)病、多發(fā)病。中藥復(fù)方制劑治療該病的實(shí)驗(yàn)室研究也成為近年來(lái)的熱門(mén)，隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，從細(xì)胞分子水平來(lái)研究防治該病的作用機(jī)制也越來(lái)越多。穿蛭膏是王振會(huì)老中醫(yī)在繼承祖?zhèn)鞯幕A(chǔ)上，經(jīng)過(guò)幾十年臨床實(shí)踐研制而成的治療骨質(zhì)增生的中藥方劑，該方著眼治本，多以補(bǔ)肝腎、益精壯骨為主，輔以祛風(fēng)除濕散寒，活血化癖通絡(luò)，在實(shí)踐中取得了滿意的療效。本研究利用兔膝關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生癥模型對(duì)一氧化氮(NO)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的檢測(cè)，探討穿蛭膏的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康7～8月齡日本大耳白兔28只，雌雄各半，重2.5～2.7 kg(平均2.6 kg)，由吉林醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物與試劑

穿蛭膏處方由阿魏、甲珠、三七、水蛭、乳香、徐長(zhǎng)卿等十余味中藥組成［2］，以上藥物均購(gòu)于吉林大藥房，由吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院制成膏藥備用。骨質(zhì)增生一貼靈，批號(hào):豫衛(wèi)健用字(2003)第0229號(hào)，香港現(xiàn)代國(guó)際藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

美國(guó)酶標(biāo)儀MK3型，3K30型低溫高速離心機(jī)(美國(guó)sigma公司)，上海電熱恒溫水箱，分光光度計(jì)等。

NO試驗(yàn)盒由南京生物建成公司生產(chǎn)，IL-1β酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑(批號(hào):0510132)、TNF-a酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑(批號(hào):腸10118)(以上試劑均購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)服務(wù)有限公司)均為進(jìn)口分裝。

1.3 兔膝關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生模型及分組

參考經(jīng)典Hulth手術(shù)造模方式，每兔耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后，固定在手術(shù)臺(tái)上，選左膝無(wú)菌條件下施行手術(shù)，顯露膝關(guān)節(jié)，切除內(nèi)側(cè)半月板并切斷內(nèi)側(cè)后韌帶后逐層縫合切口。為了預(yù)防感染可適當(dāng)給予抗生素，7 d后切口基本長(zhǎng)好，可每日驅(qū)趕白兔2次，每次30 min，4周后模型完成。

模型完成后，將兔隨機(jī)分成3組，每組7只，模型組不作任何處理;穿蛭膏組用穿蛭膏(0.52 g/每貼)貼敷患側(cè)膝關(guān)節(jié)，每2 d換藥1次;骨質(zhì)增生一貼靈組用骨質(zhì)增生一貼靈(0.51 g/每貼)貼敷患側(cè)膝關(guān)節(jié)，每2 d換藥一次。治療8周，于最后一次治療完畢后，采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死3組動(dòng)物。

1.4 標(biāo)本取材及檢測(cè)

按造模切口打開(kāi)膝關(guān)節(jié)，肉眼觀察并記錄膝關(guān)節(jié)面軟骨情況，切除脛骨干和內(nèi)側(cè)股骨髁表面的軟骨，甲醛固定，EDTA液脫鈣，常規(guī)脫水，浸蠟包埋，5 μm切片，HE及甲苯藍(lán)染色，觀察軟骨形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)量和損傷程度，并采用Mankin法［3］對(duì)關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行評(píng)分。每兔耳緣靜脈取血，分離血清，-20℃保存?zhèn)錂z。關(guān)節(jié)液標(biāo)本采集按畢氏［4］等介紹的關(guān)節(jié)沖洗液抽取方法，獲得4組兔膝關(guān)節(jié)沖洗液，回收量為0.4～0.6 mL，平均0.5 mL，于-20℃低溫冰箱中保存待測(cè)。

采用硝酸還原酶法檢測(cè)NO含量;用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELIsA)檢測(cè) IL-1β、TNF-a含量。以上均嚴(yán)格按試劑盒上方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo)

肉眼觀察關(guān)節(jié)面平整、粗糙、裂隙、糜爛等，色澤正常、灰暗，軟骨剝脫，軟骨下骨暴露，纖維性增生及邊緣是否有骨贅形成等。鏡下觀察軟骨組織結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞數(shù)量和軟骨損傷程度。

染色觀察關(guān)節(jié)軟骨的變化并行Mankin's評(píng)分，Mankin's評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［5］見(jiàn)表1。檢測(cè)外周血中及關(guān)節(jié)沖洗液中 IL-1β、TNF-α、NO 含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS12.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

肉眼可見(jiàn)正常對(duì)照組，表面完整、光滑、色澤正常，無(wú)缺損及新生物;模型對(duì)照組，表面明顯粗糙、肥厚、中度糜爛、外露的軟骨下骨破壞，骨松質(zhì)暴露;骨質(zhì)增生一貼靈組，表面粗糙、關(guān)節(jié)面有小裂隙，關(guān)節(jié)面潰瘍，滑膜色澤暗紅;穿蛭膏組，表面略顯粗糙，尚完整，有些輕度糜爛，色澤灰暗。

鏡下各組關(guān)節(jié)軟骨Mankin's評(píng)分結(jié)果，正常對(duì)照組0.3±0.3，模型對(duì)照組8.4±1.7，骨質(zhì)增生一貼靈組6.2±1.5、穿蛭膏組4.8±1.4;正常組與其他3組有顯著性差異(P＜0.01);模型組與兩治療組有顯著性差異(P＜0.01);穿蛭膏組與骨質(zhì)增生一貼靈組有顯著性差異(P＜0.05)。說(shuō)明這兩組對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的病理?yè)p傷均有不同程度的減輕，穿蛭膏作用更明顯。

各組血清及關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、NO見(jiàn)表2和3。由表2可知，穿蛭膏與骨質(zhì)增生一貼靈均能顯著降低實(shí)驗(yàn)性兔膝骨關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生模型血清中IL-1β、TNF-α、NO 的含量(P ＜0.05，P ＜0.01)，穿蛭膏組與骨質(zhì)增生一貼靈組比較差異不明顯(P＞0.05)。

由表3可知，穿蛭膏組關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α和NO與模型組、正常對(duì)照組和骨質(zhì)增生一貼靈組比較均有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)，說(shuō)明穿蛭膏可明顯降低兔膝關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生模型關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、NO 的水平。

3 討論

骨質(zhì)增生是由風(fēng)寒濕長(zhǎng)期侵襲作用，加上受壓、勞損等刺激引起的骨和骨關(guān)節(jié)慢性病變。病變初始只產(chǎn)生一些炎性細(xì)胞因子，繼而在細(xì)胞因子的刺激誘導(dǎo)下軟骨細(xì)胞功能減退、軟骨基質(zhì)的分解加速、軟骨組織的磨損，逐漸導(dǎo)致骨質(zhì)破壞，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨面破壞，軟骨下骨質(zhì)硬化，進(jìn)而繼發(fā)滑膜癥和關(guān)節(jié)周邊的骨質(zhì)增生或骨刺形成。

表1 關(guān)節(jié)軟骨鏡下Mankin's評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 各組血清中 IL-1β、TNF-α、NO 檢測(cè)分析(s，n=7)

表2 各組血清中 IL-1β、TNF-α、NO 檢測(cè)分析(s，n=7)

與正常組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01;與骨質(zhì)增生一貼靈組比較﹠P＜0.05

組 別 IL-1β(ng/mL)TNF-α(ng/mL)NO(μmol/mL)0.46±0.04 9.33±4.28 79.37±24.41模型對(duì)照組 0.98±0.08＊＊ 38.24±11.47＊＊ 107.46±32.19*骨質(zhì)增生一貼靈組 0.56±0.05＊＊# 27.62±7.05＊＊## 56.25±22.34*#穿蛭膏組 0.49±0.07#﹠ 23.58±9.14＊＊## 48.34±23.21*#正常對(duì)照組

表3 各組關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、NO檢測(cè)分析(s，n=7)

表3 各組關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、NO檢測(cè)分析(s，n=7)

與正常組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01;與骨質(zhì)增生一貼靈組比較﹠P＜0.05

組 別 IL-1β(ng/mL)TNF-α(ng/mL)NO(μmol/mL)0.21±0.09 1.52±0.31 43.56±18.62模型對(duì)照組 0.53±0.06＊＊ 2.97±0.34＊＊ 74.36±27.13*骨質(zhì)增生一貼靈組 0.39±0.05＊＊## 2.29±0.22＊＊## 49.44±29.37#穿蛭膏組 0.32±0.07＊＊##﹠ 2.11±0.24＊＊##﹠ 42.82±25.32正常對(duì)照組#

NO為一種自由基氣體，是一種生理和病理生理介質(zhì)［6］。本實(shí)驗(yàn)中模型組與正常對(duì)照組在血清和關(guān)節(jié)液中NO都有顯著性差異(P＜0.05)，說(shuō)明在此病變過(guò)程中，NO在炎性因子等的刺激下水平升高。Grrabowski認(rèn)為［7］，在關(guān)節(jié)內(nèi)炎性介質(zhì)(IL-1β)誘導(dǎo)下，軟骨母細(xì)胞中的誘導(dǎo)型NO(iNOS)合成被激活，產(chǎn)生大量的NO。有報(bào)道稱［8］該病患者血清及滑膜液中NO含量增高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。一般認(rèn)為，NO在骨關(guān)節(jié)炎中的產(chǎn)生是一系列的連鎖反應(yīng)，炎性細(xì)胞因子可誘導(dǎo)出高水平的NO，NO抑制軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖和Ⅱ型膠原，抑制軟骨細(xì)胞增殖，激活金屬蛋白酶和環(huán)氧合酶，促進(jìn)膠原降解并使前列腺素E2(PGE2)水平上升，造成了對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞。

細(xì)胞因子［9］(cytokine)是一類(lèi)由造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)或炎癥反應(yīng)中的活化細(xì)胞產(chǎn)生的具有高活性多功能的多肽、蛋白質(zhì)或糖蛋白。目前研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、TNF-α是重要的細(xì)胞因子，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、物質(zhì)代謝和生長(zhǎng)發(fā)育、胚胎發(fā)生等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用。TNF-α能選擇性地抑制軟骨膠原的產(chǎn)生，抑制蛋白聚糖的合成，同時(shí)促其降解，與軟骨破壞及滑膜炎有一定關(guān)系［10］，TNF-α在發(fā)病中與IL-1β起著協(xié)同作用。IL-1β、TNF-α的存在，能引發(fā)滑膜炎癥和細(xì)胞因子介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨的破壞［11］。IL-1也是最經(jīng)典的炎癥調(diào)節(jié)劑，有IL-1α和 IL-1β兩種亞型。有學(xué)者報(bào)道培養(yǎng)膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞后，其上清液有IL-1主要以IL-1β為主，IL-1β是關(guān)節(jié)軟骨破壞的最重要的一種炎性細(xì)胞因子［12］。研究證實(shí)［13］人類(lèi)關(guān)節(jié)中的軟骨母細(xì)胞，只要加入炎性細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α等，就會(huì)導(dǎo)致軟骨自身組織的損傷。

本實(shí)驗(yàn)穿蛭膏組方中阿魏消積，散痞、疏風(fēng)、活血;甲珠通經(jīng)、消腫、活絡(luò);乳香、沒(méi)藥活血止痛，消腫生肌;三七化瘀止血，活血定痛;瓦楞子消痰積，散血塊;徐長(zhǎng)卿疏風(fēng)解熱，行氣活血;水蛭通經(jīng)，破瘀消腫。上藥合用，具有軟堅(jiān)化骨，舒筋活絡(luò)，祛風(fēng)除濕，止痹痛等功效。

可見(jiàn)穿蛭膏治療骨質(zhì)增生的作用與散風(fēng)驅(qū)寒祛除濕熱，疏通筋絡(luò)，行氣活血有關(guān)，體現(xiàn)的是中醫(yī)整體的治療觀。本研究中穿蛭膏通過(guò)抑制IL-1β、TNF-α等炎性細(xì)胞因子，同時(shí)抑制iNOS被激活，減少NO的產(chǎn)生，從而減輕軟骨組織的損傷，達(dá)到抑制軟骨細(xì)胞凋亡，阻止軟骨基質(zhì)降解、修復(fù)或延緩關(guān)節(jié)軟骨退變作用，說(shuō)明穿蛭膏有抗氧化和清除自由基等作用，以減輕它們對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的損害。另一方面也增強(qiáng)了機(jī)體免疫功能，穩(wěn)定了關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境而起到了關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用。

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