王俊霞 王超 呂品田

胃癌是臨床常見(jiàn)的腫瘤疾病之一，傳統(tǒng)的放療和化療對(duì)晚期胃癌達(dá)不到令人滿(mǎn)意的療效，抗腫瘤細(xì)胞增殖的藥物被認(rèn)為是比較有前途的抗癌藥物。氧化苦參堿(OXY)是中藥苦參的主要生物堿之一，研究表明，OXY在體外能抑制人的胰腺癌［1］、卵巢癌［2］等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但OXY對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制筆者尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在觀(guān)察OXY對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、增殖相關(guān)因子PCNA的影響，并探討OXY調(diào)控PCNA抗腫瘤的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人胃癌敏感細(xì)胞株SGC7901購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。

1.1.2 主要試劑：氧化苦參堿(OXY)購(gòu)自寶雞永嘉天然植物開(kāi)發(fā)有限公司;磺酰羅丹明(SRB)購(gòu)自IL公司;PD98059購(gòu)自Sigma公司;p38絲裂原活化激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;PCNA、GAPDH引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，PCNA(302 bp)：5’-GTGAATTTGCACGTATATGCCG-3’(上 游)，5’-GCAATTTTATACTCTACAACAAGGGG-3’(下游);GAPDH(452 bp)：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’(上游)，5’-TCCACCACCCTGTTGCTG-3’(下游)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640中，于5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 SRB法檢測(cè)OXY的細(xì)胞毒性：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901細(xì)胞分組實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組加入OXY(使終濃度分別為1.0、2.0、4.0 mg/ml);對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液。作用48 h后進(jìn)行SRB法，酶標(biāo)儀545 nm處測(cè)定每孔OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定細(xì)胞周期：SGC7901細(xì)胞加入1.0、2.0、4.0 mg/ml OXY作用48 h，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 OXY對(duì)SGC7901細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響：SGC7901細(xì)胞分為OXY組(4.0 mg/ml OXY)和對(duì)照組(培養(yǎng)液)，作用48 h后收集細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QPCR)檢測(cè)PCNA mRNA的表達(dá)，擴(kuò)增完成后，將對(duì)照組設(shè)為1，以PCNA/GAPDH的比值RQ用于統(tǒng)計(jì)分析;蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)PCNA蛋白的表達(dá)，最后以PCNA光密度值/GAPDH光密度值的比值作為PCNA的相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 OXY 對(duì) SGC7901細(xì)胞 p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)的影響：SGC7901細(xì)胞分為OXY組(4.0 mg/ml OXY)和對(duì)照組(培養(yǎng)液)，作用48 h后收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè) p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK蛋白的表達(dá)。

1.2.6 阻斷ERK通路時(shí)OXY作用的SGC7901細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)的影響：SGC7901細(xì)胞分為：OXY組(4.0 mg/ml OXY)、OXY+ERK抑制劑PD98059干預(yù)組(PD組，20μmol/L PD98059作用1 h后再加入4.0 mg/ml OXY繼續(xù)培養(yǎng)48 h)和對(duì)照組(培養(yǎng)液)。收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)PCNA、ERK、p-ERK蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OXY對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞抑制率的影響 OXY對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞有抑制作用，1.0、2.0、4.0 mg/ml OXY抑制率分別為(14±4)%、(49±6)%、(67±9)%，可見(jiàn)隨著OXY濃度增大，抑制率明顯上升。

2.2 OXY對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組比，1.0、2.0、4.0 mg/ml OXY 處理 SGC7901細(xì)胞后，G1期的細(xì)胞均顯著增加(P＜0.05或＜0.01)，S期細(xì)胞明顯減少(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 OXY對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞周期分布的影響n(yōu)=6，%，±s

表1 OXY對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞周期分布的影響n(yōu)=6，%，±s

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

2.0 75±11# 10.9±2.2# 14±4 4.0 76±12# 8.6±1.4#15±3

2.3 OXY對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響 4.0 mg/ml OXY處理細(xì)胞48 h后，OXY組細(xì)胞PCNA mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05或＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 OXY對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響n(yōu)=3，±s

表2 OXY對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響n(yōu)=3，±s

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

OXY組 0.32±0.010.24±0.03

2.4 OXY對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞p38MAPK、JNK、ERK及磷酸化的影響 經(jīng)4.0 mg/ml OXY處理48 h細(xì)胞后ERK的磷酸化受到明顯抑制，與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但ERK蛋白表達(dá)、p38MAPK、JNK及磷酸化表達(dá)均無(wú)明顯變化(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3 OXY對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞p38MAPK、JNK、ERK蛋白的表達(dá)n=3，±s

表3 OXY對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞p38MAPK、JNK、ERK蛋白的表達(dá)n=3，±s

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

OXY組 0.39±0.08 0.59±0.07 0.69±0.09 0.41±0.05 0.42±0.05 0.42±0.06*

2.5 阻斷ERK通路時(shí)OXY作用的SGC7901細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)變化 與對(duì)照組比較，OXY組PCNA、p-ERK表達(dá)均明顯下降(P＜0.05)，預(yù)先加入ERK抑制劑PD98059的PD組與OXY組比較，PCNA表達(dá)明顯上升(P＜0.05)，p-ERK的水平進(jìn)一步下降(P＜0.05)，表明ERK抑制劑PD98059可以協(xié)同OXY抑制p-ERK的表達(dá)。見(jiàn)表4。

表4 3組細(xì)胞中PCNA、ERK、p-ERK的表達(dá)變化n=3，±s

表4 3組細(xì)胞中PCNA、ERK、p-ERK的表達(dá)變化n=3，±s

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與OXY組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

PD組 0.58±0.110.43±0.05 0.21±0.03

3 討論

OXY具有廣泛的藥理活性，具有抗菌、抗病毒的作用，最近其抗腫瘤及耐藥性［3］的作用也逐步引起人們的關(guān)注。OXY能通過(guò)抗增殖的作用抑制卵巢癌等細(xì)胞的生長(zhǎng)，我們的SRB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OXY尚能抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖，其濃度及抑制率與張瓊等［2］在卵巢癌中的報(bào)道基本一致。

細(xì)胞正常的分裂、增殖、分化與衰老維持著機(jī)體自身的穩(wěn)定，細(xì)胞周期的異常會(huì)導(dǎo)致這一系列過(guò)程的紊亂，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。觀(guān)察到OXY可使胃癌細(xì)胞周期發(fā)生變化，G1期細(xì)胞均顯著增加，S期細(xì)胞明顯減少。蛋白PCNA的表達(dá)與細(xì)胞周期密切相關(guān)，能夠反映細(xì)胞增殖分?jǐn)?shù)和所處的周期［4］，本結(jié)果顯示OXY能夠下調(diào)PCNA的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤增殖的作用。

MAPKs信號(hào)通路是細(xì)胞賴(lài)以接受外界刺激信號(hào)并作出相應(yīng)反應(yīng)的重要傳導(dǎo)通路，參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程［5］。本結(jié)果顯示OXY干預(yù)SGC7901細(xì)胞后，ERK的磷酸化水平明顯下降，但ERK蛋白表達(dá)、p38MAPK、JNK及磷酸化表達(dá)均無(wú)變化。ERKs信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)［6］，本實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先加入ERK抑制劑PD98059［7］可以協(xié)同OXY抑制p-ERK的表達(dá)，提示OXY能通過(guò)抑制MAPK/ERK信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子ERK的磷酸化而抑制胃癌細(xì)胞的增殖過(guò)程。綜合 OXY對(duì)細(xì)胞周期的影響結(jié)果，推測(cè) OXY調(diào)控SGC7901細(xì)胞增殖可能的途徑為：抑制ERK磷酸化→G1期CDK復(fù)合物減少→S期抑制因子增多→細(xì)胞增殖阻滯于S期→細(xì)胞停止增殖→PCNA表達(dá)下降。這一途徑的闡明，為開(kāi)發(fā)胃癌治療藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 冀潤(rùn)利，邸瑤，夏時(shí)海，等.氧化苦參堿對(duì)SW1990細(xì)胞MMP-2表達(dá)的抑制作用及對(duì)細(xì)胞侵襲力的影響.世界華人消化雜志，2011，19：19-24.

2 張瓊，潘平東.氧化苦參堿對(duì)人卵巢癌HO-8910細(xì)胞的作用及其機(jī)制的初步研究.醫(yī)學(xué)信息，2010，23：3381-3383.

3 呂建裕，趙瑛.氧化苦參堿逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADM耐藥的研究.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48：86-87.

4 Czyzewska J，Guzińska-Ustymowicz K，Pryczynicz A，et al.Immunohistochemical evaluation of Ki-67，PCNA and MCM2 proteins proliferation index(PI)in advanced gastric cancer.Folia Histochem Cytobiol，2009，47：289-296.

5 Shigematsu H，Yoshida K，Sanada Y，et al.Rapamycin enhances chemotherapy-induced cytotoxicity by inhibiting the expressions of TSand ERK in gastric cancer cells.Int J Cancer，2010，126：2716-2725.

6 Lo HW.Targeting Ras-RAF-ERK and its interactive pathways as a novel therapy for malignant gliomas.Curr Cancer Drug Targets，2010，10：840-848.

7 Rasola A，Sciacovelli M，Chiara F，et al.Activation of mitochondrial ERK protects cancer cells from death through inhibition of the permeability transition.Proc Natl Acad Sci U SA，2010，107：726-731.