包永芬 單士剛

甲醛(FA)是一種無色、強嗅的刺激性氣體，它具有來源廣泛、污染時間長、相對污染水平高、生物毒性大等特點，因此，越來越受到人們的廣泛關(guān)注。FA是常見的裝修型化學(xué)污染物之一，氧化損傷和DNA鏈斷裂為甲醛毒作用的重要機制［1，2］。有報道，甲醛吸入可引起小鼠腦、肝、心等多種組織器官的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和酶的氧化損傷［3，4］。大蒜多糖(garlic polysaccharide，GP)是大蒜的主要成分之一，研究表明具有抗氧化、保護肝臟等多方面的生理功能［5］。為了探討大蒜多糖對肝細(xì)胞的營養(yǎng)和保護作用，本研究以健康人胚肝細(xì)胞L02為對象，用甲醛造成細(xì)胞損傷模型，觀察不同濃度的大蒜多糖對L02細(xì)胞的遺傳損傷和抗氧化效果，為臨床防治甲醛致病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑 人正常肝細(xì)胞L02購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。低熔點瓊脂糖、胎牛血清和1640培養(yǎng)基均為Gibco公司產(chǎn)品。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 大蒜多糖提取分離 新鮮大蒜去皮→碾成蒜泥→無水乙醇浸泡過夜→尼龍布過濾→沉淀用無水乙醇浸泡1 h→尼龍布過濾→沉淀用無水乙醇浸泡24 h→尼龍布過濾→沉淀(即脫脂蒜泥)用雙蒸水溶解→沸水浴8 h冷卻→尼龍布過濾→濾液中滴加4～5倍無水乙醇→靜置72 h抽濾→濾液68℃水浴約8 h蒸出乙醇→濾液中滴加3～4倍丙酮→靜置6 h抽濾→得大蒜多糖組分C粗品。粗品Sevage法去蛋白后于55℃紅外線干燥得淡黃色粉末即GP。

1.3 實驗分組 L02細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化傳代后置含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。共設(shè)5組：對照組(正常細(xì)胞組)、甲醛損傷組(0.1 mmol/L)及低、中、高劑量大蒜多糖(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)保護組;其中大蒜多糖先與細(xì)胞預(yù)孵8 h后加入甲醛，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.4 細(xì)胞DNA損傷的檢測 用單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳(single cell gelelectrophoresis，SCGE)評價大蒜多糖各濃度實驗組處理L02細(xì)胞4hDNA的損傷程度。每個樣本用cAsP軟件隨機分析1 000個細(xì)胞的彗星尾距。

1.5 AST、LDH、MDA、SOD和GSH-Px的測定 分別收集大蒜多糖各濃度實驗組處理L02細(xì)胞4h時的上清液和細(xì)胞裂解液。選擇釋放到上清的AST和LDH反映肝細(xì)胞受損程度，細(xì)胞MDA水平反映脂質(zhì)過氧化程度，GSH和SOD水平反映內(nèi)源抗氧化能力的大小。(1)上清指標(biāo)測定：酶動力學(xué)法測定LDH、AST，具體步驟按試劑盒說明操作。(2)細(xì)胞指標(biāo)測定：1%Triton-X 100裂解細(xì)胞，硫代巴比妥酸比色法測定MDA;黃嘌呤氧化酶法測定SOD;DNTB比色法測定GSH。具體步驟按試劑盒說明操作。Lowry法進行蛋白定量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析(One Way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大蒜多糖對甲醛引起的細(xì)胞DNA損傷保護作用 采用單細(xì)胞凝膠電泳法檢測發(fā)現(xiàn)，在0.1 mmol/L水平時，甲醛對L02細(xì)胞DNA的損傷。Tail Moment和Tail DNA與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);預(yù)孵大蒜多糖1 h后的L02細(xì)胞加入0.1 mmol/L甲醛作用4 h后與甲醛損傷組比較，Tail Moment和Tail DNA都明顯減少，并與大蒜多糖濃度增加呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 不同濃度大蒜多糖預(yù)孵8 h后0.1 mmoL/L甲醛4 h暴露組細(xì)胞DNA損傷 n=6

2.2 LDH、AST、MDA 水平和 SOD、GSH-Px活性的變化0.1 mmol/L甲醛可以使L02細(xì)胞上清液中的LDH漏出量、AST和MDA的釋放量釋放增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，SOD和GSH-Px的活性下降與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);預(yù)孵大蒜多糖1 h后的L02細(xì)胞加入0.1 mmol/L甲醛作用4 h后與甲醛損傷組比較細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性明顯增加，LDH漏出量、AST和MDA的釋放量明顯減少，并與大蒜多糖濃度增加呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 不同濃度大蒜多糖預(yù)孵8 h后0.1 mmoL/L甲醛4 h暴露組氧化性損傷指標(biāo)n=6，±s

表2 不同濃度大蒜多糖預(yù)孵8 h后0.1 mmoL/L甲醛4 h暴露組氧化性損傷指標(biāo)n=6，±s

注：與甲醛組比較，*P＜0.05;與對照組比較，#P＜0.05

組別 LDH(U/L)AST(U/L)MDA(nmol/ml)GSH(mg/mg)SOD(U/ml)±0.08甲醛組 12.6±0.4# 2.73±0.45# 1.98±0.23# 58.41±5.17# 3.25±0.48#預(yù)處理組(mg/L)對照組 7.0±0.9 1.52±0.23 0.93±0.12 99.10±8.56 4.99 20 10.7±1.0* 1.80±0.21* 1.37±0.16* 70.27±6.72* 3.47±0.54 40 9.2±0.9* 1.74±0.25* 1.05±0.31* 75.96±8.86* 5.05±0.52*80 7.6±0.8* 1.52±0.10* 1.03±0.62* 85.83±5.70* 4.84±0.16*

3 討論

本文研究了大蒜水提取物(GP)對甲醛誘導(dǎo)氧化損傷和遺傳損傷的抑制作用。實驗分為5組：對照組，甲醛組，大蒜多糖預(yù)處理組：分設(shè)20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L不同濃度預(yù)處理組。采用單細(xì)胞凝膠電泳法檢測發(fā)現(xiàn)，在0.1 mmol/L水平時，甲醛對L02細(xì)胞DNA的損傷。結(jié)果表明Tail Moment和Tail DNA與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);預(yù)孵大蒜多糖8 h后的L02細(xì)胞加入0.1 mmoL/L甲醛作用4 h后與甲醛損傷組比較，Tail Moment和Tail DNA都明顯減少，并與大蒜多糖濃度增加呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。0.1 mmol/L甲醛可以使L02細(xì)胞上清液中的LDH漏出量、AST和MDA的釋放量釋放增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，SOD和GSH-Px的活性下降與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);預(yù)孵大蒜多糖8 h后的L02細(xì)胞加入0.1 mmoL/L甲醛作用4 h后與甲醛損傷組比較細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性明顯增加，LDH漏出量，AST和MDA的釋放量明顯減少，并與大蒜多糖濃度增加呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，其差異均有顯著性(P＜0.05)。上述實驗結(jié)果表明，GP有較強的抗氧化作用和遺傳損傷的保護作用，它可能通過保護組織不受氧化損傷和遺傳損傷而拮抗甲醛的毒性。然而GP的這些作用可能具有特異性依賴，所以尚需進一步進行人體試驗。

1 于光艷，劉基芳，李鐵驥，等.甲醛對小鼠肺組織形態(tài)及脂質(zhì)過氧化物水平的影響.吉林大學(xué)(醫(yī)學(xué)版)，2004，30：888-892.

2 Lin Z，Luo W，Li H，et al.The efect ofendogenous formaldehyde on the rat aorta endothelial cells.Toxieol Lett，2005，159：134-143.

3 段麗菊，朱燕，胡青蓮，等.甲醛吸入效小鼠蛋白質(zhì)氧化損傷作用的研究.環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2005，25：851-854.

4 劉杰，劉宏亮，楊旭，等.氣態(tài)甲醛對小鼠組織器官SOD的抑制作用.環(huán)境與健康雜志，2003，20：181-183.

5 孔祥槐，鄭敏，張明霞，等.大蒜多糖B對小鼠免疫性肝損傷的干預(yù)作用.時珍國醫(yī)國藥，2010，21：2289-2290.