葉云峰， 付 崗， 劉 威， 蔣 妮， 劉麗輝， 胡鳳云

（1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530023；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，南寧 530007）

貓豆［Mucunapruriens（Linn.）DC.］，別名刺毛黧豆、狗爪豆、貓爪豆、龍爪豆、虎爪豆等，是豆科黧豆屬一年生藤本植物。貓豆在非洲、印度和加勒比均有種植，在我國主要分布于亞熱帶石山地區(qū)［1］。廣東、廣西、貴州、海南、臺灣和云南等南部省區(qū)均有種植，其中，廣西是貓豆的主產(chǎn)區(qū)，種植面積超過1 500 hm2。貓豆種子是生產(chǎn)治療帕金森氏病的經(jīng)典藥物左旋多巴的重要原材料［2］，還含有抵抗蛇毒［3］和抗糖尿病［4］的活性成分，并具有壯陽活性，民間用于治療性障礙［5］。此外，貓豆還具有重要的食用價值和飼料價值。目前，貓豆在廣西已經(jīng)形成了“種植—加工—養(yǎng)殖／醫(yī)藥化工”產(chǎn)業(yè)鏈。近年來，隨著貓豆在廣西種植面積的增加，出現(xiàn)了一些危害較重的病蟲害，其中，炭疽病為主要病害，發(fā)病率為30%左右，病重地塊達(dá)70%，主要危害貓豆的葉片、莖蔓和豆莢，大大降低了貓豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。該病在廣西的龍州縣、隆安縣、天等縣、貴港市等地均有發(fā)生。目前尚無該病病原的報(bào)道，作者對廣西貓豆炭疽病病原進(jìn)行分離和鑒定，以期為該病害的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

患病的貓豆病株采自廣西壯族自治區(qū)龍州縣八角鄉(xiāng)。對田間自然感病植株進(jìn)行癥狀描述。

1.2 病原菌的分離純化

選取貓豆葉片、莖蔓及豆莢的病健交界處病組織，切成0.5 cm×0.5 cm小塊，用75%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞消毒1 min，再用無菌水漂洗3次，置于PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，待長出菌絲后，挑取菌落邊緣進(jìn)行純化，純化后的菌落通過單孢分離獲得純培養(yǎng)分離物。

1.3 分離物的致病性測定

1.3.1 室內(nèi)離體接種

將純培養(yǎng)的分離物菌絲塊通過針刺接種法接種到健康的貓豆葉片、莖稈及豆莢上，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)，以針刺傷口處放PDA培養(yǎng)基塊的葉片、莖稈及豆莢為對照，定期觀察各組織的發(fā)病情況，發(fā)病后再對病斑進(jìn)行病原菌分離。

1.3.2 田間接種

將在PDA上培養(yǎng)7 d的分離物配成孢子懸浮液（105個孢子／mL），噴施于田間種植的健康的貓豆葉片、莖稈及豆莢上，設(shè)刺傷和無傷口接種2個處理，以噴施無菌水的植株為對照，每處理接種20株貓豆，定期觀察發(fā)病情況，發(fā)病后從病斑上再次分離病原菌。

1.4 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察病原菌在PDA平板上的菌落特征，顯微觀察菌絲體、分生孢子等的形態(tài)特征，對病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

病原菌DNA提取采用CTAB法［6］。以ITS4 5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′ 和 IT5 5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′為 引 物，PCR擴(kuò)增菌株的ITS r DNA序列。反應(yīng)在50μL體系中進(jìn)行，體系含有10×Ex Buffer 5μL，d NTP（2.5 mmol／L）1μL，Primer ITS4 （10μmol／L）2μL，Primer ITS5 （10μmol／L）2μL，Genomic DNA 100 ng，ExTaq（5 U／μL）0.5μL；dd H2O 補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃復(fù)性80 s，33個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目標(biāo)DNA片段，由北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

該病主要危害貓豆的葉片、莖蔓和豆莢。葉片感病后，病斑從葉尖或葉緣呈“V”字形或不規(guī)則形向葉片中間部位擴(kuò)展，病斑初始為黃色，后變褐色、干枯，病斑周圍黃色，病葉后期穿孔。莖蔓上的病斑初始為近圓形或不規(guī)則形褐色斑，隨后朝橫向和縱向擴(kuò)展成黑褐色大斑，病斑稍凹陷，嚴(yán)重時導(dǎo)致莖蔓枯死。豆莢感病后在表面形成黑色近圓形或不規(guī)則形凹陷病斑，多個病斑擴(kuò)大融合成片，使豆莢癟小或生長不良，天氣潮濕時，在病斑上形成粉紅色黏性物（圖1）。該病害在貓豆的成株期至生長后期（6月－11月）均可發(fā)生，最早在葉片上出現(xiàn)癥狀，隨后感染莖蔓和豆莢。種植密度大、偏施氮肥的地塊發(fā)病較重；高溫多雨時期發(fā)病較重，蔓延迅速。

圖1 貓豆炭疽病田間癥狀Fig.1 Natural symptoms of velvet bean anthracnose

2.2 病原菌的分離和致病性測定

對貓豆葉片、莖蔓和豆莢各5個病害標(biāo)樣進(jìn)行病原分離，分離純化得到形態(tài)特征一致的菌株21株。這些菌株經(jīng)針刺法接種到離體的葉片、莖蔓和豆莢上，發(fā)病率可達(dá)100%。接種后第3天，葉片發(fā)病，第7天，莖蔓和豆莢發(fā)病，均在接種部位形成黑色近圓形病斑，癥狀比田間自然發(fā)病癥狀較重（圖2）。田間刺傷法接種的植株發(fā)病較早，接種病原后第7天，葉片發(fā)病，第12天莖蔓和豆莢開始發(fā)病，發(fā)病率為100%。無傷口接種的植株發(fā)病時間晚7～10 d，發(fā)病率為70%。田間接種的癥狀和自然發(fā)病癥狀相同。對照植株不發(fā)病。從發(fā)病的病斑上能再分離到與接種菌株形態(tài)一致的病原菌。

圖2 貓豆炭疽病離體接種癥狀Fig.2 Inoculation symptoms of velvet bean anthracnose

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌在PDA平板上，菌落圓形，邊緣整齊，氣生菌絲初為白色，后漸變?yōu)榛野咨蛏罨疑z排列整齊，毛絨狀。培養(yǎng)7 d后，靠近菌落中央產(chǎn)生輪紋狀排列的分生孢子盤，并在其上產(chǎn)生紅色分生孢子團(tuán)。分生孢子盤圓形或橢圓形，黑褐色，直徑（100～300）μm；剛毛少，暗褐色，橫隔1～2個，（65～70）μm×（5～6）μm；分生孢子梗短，圓筒形，基部淺褐色，（12～20）μm×（4～5）μm；分生孢子單胞，無色，長橢圓形，兩頭鈍圓或一端稍尖，大?。?1.5～20.3）μm×（4.2～6.0）μm，平均為15.9μm×5.1μm（圖3）。參照《真菌鑒定手冊》［7］及《植物病原真菌學(xué)》［8］，將該病原菌鑒定為膠孢炭疽菌［Colletotrichumgloeosporioides（Penz.）］。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

將病原菌的DNA通過PCR擴(kuò)增后，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得530 bp的DNA序列（圖4）。該序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast比較，與已報(bào)道的多個膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）及其有性態(tài)圍小叢殼 菌 ［Glomerellacingulata（Stonem.）Spauld.et Schrenk］的序列相似性最高，相似性達(dá)99%～100%。

圖3 貓豆炭疽病病原形態(tài)Fig.3 Pathogen morphology of velvet bean anthracnose

圖4 貓豆炭疽病病原菌的ITS r DNA序列Fig.4 ITS r DNA sequence of the velvet bean anthracnose pathogen

3 結(jié)論與討論

近年來，貓豆在廣西大面積種植，已經(jīng)成為部分農(nóng)民脫貧致富的途徑之一，然而，貓豆炭疽病的發(fā)生給貓豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和農(nóng)民的增收產(chǎn)生較大的影響，至今尚無關(guān)于該病的研究報(bào)道。為明確該病病原和有效控制病害的發(fā)生，本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)特性，將該病原鑒定為膠孢炭疽菌。膠孢炭疽菌是世界上分布最廣的植物病原菌之一，危害多種寄主植物，但該病原危害貓豆為國內(nèi)首次報(bào)道。此外，膠孢炭疽菌在致病性、寄主特異性和遺傳同質(zhì)性等方面可分成許多亞組，屬多形態(tài)種［9］，對所獲得的菌株的寄主范圍及?；偷拇_定尚待進(jìn)一步的工作。由于膠孢炭疽菌引起的多種植物病害的侵染循環(huán)和發(fā)病條件相似，因此，可參考由該病原引起的其他作物炭疽病的防治方法進(jìn)行控制，如選用無病種子或進(jìn)行種子消毒、及時清除病殘?bào)w、合理密植、創(chuàng)造良好的通風(fēng)透光條件、合理施肥用水等，或在發(fā)病初期使用25%咪鮮胺乳油1 500倍液噴霧［10］。具體防治藥劑及綜合防治技術(shù)的建立尚待室內(nèi)篩選試驗(yàn)和田間實(shí)踐驗(yàn)證。

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