杜 蕙， 漆永紅， 呂和平， 陳書龍， 陳 明＊

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，蘭州 730070；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，保定 071000）

根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）是一類在蔬菜作物上危害極大的植物病原線蟲，其寄主范圍廣，種類多，分布廣，能侵染幾乎所有蔬菜作物。據(jù)調(diào)查，2008年根結(jié)線蟲病僅在甘肅省局部地區(qū)的保護(hù)地蔬菜上發(fā)生，隨著種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，人為因素等影響，蔬菜根結(jié)線蟲病發(fā)生日趨嚴(yán)重，現(xiàn)已蔓延到幾乎全省保護(hù)地蔬菜產(chǎn)區(qū)，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，給蔬菜生產(chǎn)帶來巨大的影響［1－2］。

根結(jié)線蟲種類鑒定除傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、鑒別寄主反應(yīng)、生物化學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)等方法外，r DNA－ITS－PCR技術(shù)已被用于根結(jié)線蟲的快速分子診斷和從混合種群中識別根結(jié)線蟲種類。Zijlstra等采用ITS－RFLP技術(shù)鑒定出了北方根結(jié)線蟲（M.haplaChitwood）、奇 特 伍 德 根 結(jié) 線 蟲 （M.chitwoodiGolden et al.）和法拉克斯根結(jié)線蟲 （M.fallaxKarssen）3種十分相近的根結(jié)線蟲種群［3］。Blok等利用5S和18S引物之間的ITS區(qū)域揭示了爪哇根結(jié)線蟲［M.javanica（Treub）］、花生根結(jié)線蟲［M.arenaria（Neal）］、南方根結(jié)線蟲［M.incognita（Kofoid et White）］、瑪亞圭根結(jié)線蟲（M.mayaguensisRammah et Hirschmann）和北方根結(jié)線蟲的種內(nèi)和種間變異［4］。彭德良等用PCR技術(shù)研究了40多個(gè)根結(jié)線蟲群體的r DNA－ITS基因，明確了北方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲等6種根結(jié)線蟲的ITS位點(diǎn)序列特征［5］。廖金鈴等研究并建立了用r DNA－ITS、線粒體DNA－PCR－RFLP和SCAR方法快速鑒定根結(jié)線蟲的方法［6］。但是，尚未對甘肅省根結(jié)線蟲種類開展研究。本試驗(yàn)以采自甘肅省11個(gè)不同區(qū)域保護(hù)地蔬菜根結(jié)線蟲種群為研究對象，采用ITS標(biāo)記，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，分析根結(jié)線蟲的同源性和親緣關(guān)系，鑒定甘肅省不同區(qū)域蔬菜根結(jié)線蟲種類，對根結(jié)線蟲病害快速診斷、種群遺傳多樣性研究及根結(jié)線蟲病害防治具有重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲

供試根結(jié)線蟲于2008－2011年從甘肅省9個(gè)市不同區(qū)域保護(hù)地蔬菜上采集，分別進(jìn)行單卵塊純化培養(yǎng)后接種于預(yù)先培植于消毒土的番茄（品種為‘毛粉802’）根部（約25 d苗齡），在溫室中培養(yǎng)45 d左右，獲得純培養(yǎng)種群11個(gè)（表1）。

表1 供試蔬菜根結(jié)線蟲樣本采集信息Table 1 Origins of the tested vegetable root－knot nematodes

1.2 試劑和儀器

PCR所用的Taq酶，d NTP，Buffer均購自TIAN GEN生化科技生物技術(shù)有限公司。

試驗(yàn)儀器為：MJ PTC－100 PCR儀，JY 600＋電泳儀，Heraeus臺式高速離心機(jī)，F(xiàn)TI－500凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.3 根結(jié)線蟲DNA提取

參照王江嶺等單條線蟲基因組DNA提取方法稍作改進(jìn)［7］。具體方法為：將從新鮮卵囊里孵化出的根結(jié)線蟲2齡幼蟲放入dd H2O中清洗，挑取單條放入200μL PCR管中（含8μL dd H2O和1μL 10×PCR Buffer），超低溫冰箱－80℃放置4 h，85℃加熱2 min，向PCR管中加入1μL 20 mg／m L蛋白酶K，56℃加熱15 min，95℃加熱10 min，高速離心（14 000 r／min）1 min，取此 DNA 上清液直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 PCR擴(kuò)增

采用Harris等［8］設(shè)計(jì)的線蟲ITS擴(kuò)增通用引物F195和V5367（由上海生工公司合成），其序列分別 為：5′－TCCTCCGCTAAATGATATG－3′和 5′－TTGATTACGTCCCTGCCCTTT－3′，對 11 個(gè) 縣（區(qū)）根結(jié)線蟲種群的ITS間隔區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用25μL反應(yīng)體系，其中10×PCR Buffer 2.5μL，2.5 mmol／L d NTP 1μL，5μmol／L 引物F195和V5367各1μL，2.5U／μLTaq酶0.5μL，DNA提取上清液3μL，加dd H2O至25μL。同時(shí)設(shè)置無DNA模板的空白對照CK。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，反應(yīng)共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。4℃ 保存?zhèn)溆谩CR產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠120 V電泳30 min進(jìn)行檢測，用1×TBE作為電泳緩沖液，并在紫外燈下觀測照相。

1.5 PCR產(chǎn)物序列測定、序列分析及同源性比較

將PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。采用MEGA軟件對所測定的序列進(jìn)行比對分析，比較11個(gè)不同地區(qū)根結(jié)線蟲種群ITS序列的同源性。

2 結(jié)果與分析

2.1 根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

對甘肅省11個(gè)不同區(qū)域根結(jié)線蟲進(jìn)行了形態(tài)學(xué)方面的鑒定，根據(jù)其2齡幼蟲、雌蟲會(huì)陰花紋及卵的形態(tài)學(xué)特征（圖1），初步確定11個(gè)不同地區(qū)保護(hù)地蔬菜根結(jié)線蟲均為南方根結(jié)線蟲（M.incognita）。

圖1 供試根結(jié)線蟲的形態(tài)特征Fig.1 The morphological characters of root－knot nematodes in the experiment

2.2 r DNA－ITS－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

用引物F195和V5367對甘肅省11個(gè)不同地區(qū)根結(jié)線蟲單條2齡幼蟲進(jìn)行r DNA－ITS－PCR擴(kuò)增后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，各地區(qū)線蟲樣本的ITS片段大小為700 bp左右（圖2）。

圖2 11個(gè)根結(jié)線蟲樣品ITS片段的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Electrophoregram of PCR product of ITS fragment from 11 root－knot nematode samples

2.3 序列測定結(jié)果

對11個(gè)根結(jié)線蟲種群的rDNA－ITS序列進(jìn)行測定，結(jié)果表明，11個(gè)蔬菜根結(jié)線蟲種群的ITS片段大小介于690～695 bp之間。其中白銀市靖遠(yuǎn)縣北灣鎮(zhèn)、定西市臨洮縣新添鎮(zhèn)、定西市隴西縣文峰鎮(zhèn)、平?jīng)鍪袥艽h五里鋪鎮(zhèn)4地根結(jié)線蟲ITS片段大小均為691 bp；蘭州市榆中縣和平鎮(zhèn)、隴南市成縣城關(guān)鎮(zhèn)、天水市麥積區(qū)中灘鎮(zhèn)3地根結(jié)線蟲ITS片段大小均為690 bp；慶陽市西峰區(qū)塞子鄉(xiāng)、定西市漳縣三臺鄉(xiāng)、酒泉市肅州區(qū)上壩鎮(zhèn)、武威市涼州區(qū)清源鎮(zhèn)4地根結(jié)線蟲ITS片段大小均為695 bp。

2.4 序列分析及同源性比較結(jié)果

經(jīng)測序后，將11個(gè)根結(jié)線蟲樣本的r DNA－ITS區(qū)域序列與GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Nucleotide BLASTN序列比對，結(jié)果表明，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物ITS區(qū)域序列與已知南方根結(jié)線蟲ITS區(qū)域序列的相似性達(dá)到99%。用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，11個(gè)根結(jié)線蟲樣本與南方根結(jié)線蟲的遺傳距離最近，而與其他根結(jié)線蟲的遺傳距離相對較遠(yuǎn)，說明甘肅省9個(gè)市的保護(hù)地蔬菜根結(jié)線蟲均為南方根結(jié)線蟲（M.incognita）。

3 結(jié)論與討論

由于根結(jié)線蟲的形態(tài)特征在進(jìn)化過程中比較保守，不同線蟲種類之間的形態(tài)特征差異較小，相對來講同種內(nèi)不同種群之間的特征變異幅度又較大，一般僅靠形態(tài)特征不能對根結(jié)線蟲進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。近年來分子生物學(xué)特征對線蟲進(jìn)行種類鑒定，已成為線蟲種類鑒定的發(fā)展趨勢。線蟲基因組DNA提取是線蟲分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，國內(nèi)外一些學(xué)者用堿裂 解 法［9］、蛋 白 酶 K 法［10］、試 劑 盒 法［11］以 及SDS法［12］等對提取單頭線蟲DNA的方法進(jìn)行了摸索和改進(jìn)，取得一些進(jìn)展。本試驗(yàn)采用PCR Buffer溶液替代WLB裂解液，使用變溫處理替代其他手工破碎能夠快速提取單頭線蟲DNA，本方法可供提取其他線蟲基因組DNA所借鑒。

圖3 基于11個(gè)根結(jié)線蟲樣本和來自GenBank不同種類根結(jié)線蟲ITS區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree of 11 samples and related Meloidogyne spp.from GenBank based on their ITS sequences

王仁剛等對北京地區(qū)保護(hù)地蔬菜根結(jié)線蟲用形態(tài)學(xué)和r DNA－ITS序列分析進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)南方根結(jié)線蟲不僅廣泛分布于我國南方地區(qū)，在北方北京地區(qū)溫室蔬菜上也有分布［13］。本研究采用r DNAITS－PCR方法，結(jié)合供試根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)特征，所有根結(jié)線蟲樣品均被鑒定為南方根結(jié)線蟲（M.incognita），供試的根結(jié)線蟲樣品來自甘肅省14個(gè)市州中的9個(gè)市的不同區(qū)域，11個(gè)采樣點(diǎn)均為目前甘肅省的主要保護(hù)地蔬菜產(chǎn)區(qū)，具有較強(qiáng)的代表性，可以基本反映全省的狀況，表明南方根結(jié)線蟲在甘肅省保護(hù)地內(nèi)已普遍發(fā)生，值得引起相關(guān)部門的高度重視。

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