劉 玲 李從榮 鄭 毅 趙友云

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科(湖北武漢，430060) 2.湖北省中醫(yī)院檢驗科

HBV基因組在復(fù)制過程中，在經(jīng)過RNA逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程中，因RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏嚴(yán)格的校正機(jī)制，使病毒基因的復(fù)制過程中極易發(fā)生核苷酸的錯配，因此，HBV是一種變異性極高的病毒。在機(jī)體自身、藥物和病毒的多重作用下，HBV DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性區(qū) (RT區(qū))會發(fā)生多種耐藥突變［1］。耐藥突變不僅會降低抗病毒治療的效果，還會使乙型肝炎進(jìn)一步進(jìn)展、惡化。HBV基因變異及其導(dǎo)致的藥物靶位氨基酸的替代是導(dǎo)致病毒耐藥的基礎(chǔ)，所以對HBV耐藥突變位點的檢測極具臨床意義。本研究的目的是建立能適用臨床檢測HBV對核苷 (酸)類似物耐藥突變的巢式PCR聯(lián)合焦磷酸測序技術(shù)的檢測體系。

1 材料與方法

1.1 病例來源 選取223例于2011年8月至2013年2月間在湖北省中醫(yī)院肝病科就診的CHB患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《慢性乙型肝炎防治指南》［2］，其中192例曾經(jīng)或現(xiàn)在接受核苷(酸)類似物治療 (用藥組)，31例此前無核苷 (酸)類似物治療史 (未用藥組)。男176人，女47人;患者年齡 (41±33)歲。

1.2 重組質(zhì)粒及標(biāo)準(zhǔn)株 HBV B、C型野生標(biāo)準(zhǔn)株由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病毒學(xué)國家重點實驗室提供，定量至2×105copies/ml，作為標(biāo)準(zhǔn)病毒DNA。HBV標(biāo)準(zhǔn)野生株重組質(zhì)粒(pHBV)873bp包含有 8個突變位點 (rt173L、rt180M、rt181V、rt184G/I/S、rt202I/G、rt204I/V/S、rt236T、rt250V/L)由上海生工生物公司合成。質(zhì)粒由2×105copies/ml逐級10倍稀釋至2×102copies/ml作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA，對巢式PCR體系進(jìn)行評估。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設(shè)計 從美國國立生物技術(shù)信息中網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載 A、B、C、D型HBVP基因片段，作為靶基因。針對其P基因RT區(qū)，在上下游使用Primer Expresx 3.0分別設(shè)計兩對引物，命名為P引物。引物除須滿足設(shè)計的基本要求外，還要保證內(nèi)外引物間有50-150bp的距離，并用Blast驗證兩對引物的特異性。第一輪引物命名為P1/P2，第二輪PCR引物命名為P3/P4(見表1)。所有的引物均委托上海生工生物公司合成。

表1 巢式PCR引物序列

1.3.2 HBV DNA提取 患者血液以EDTA抗凝后離心取血漿，按照上海復(fù)星科技有限公司生產(chǎn)的HBV檢測試劑盒說明書進(jìn)行核酸提取。

1.3.3 巢式PCR反應(yīng)體系及參數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)病毒HBV DNA(濃度為2×105copies/ml且包括B/C型)、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA(濃度為2×105copies/ml至2×102copies/ml)，每個標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA均平行重復(fù)兩次。根據(jù)在同一擴(kuò)增條件下不同反應(yīng)體系擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳條帶效果和PCR速度最快原則來確定最優(yōu)反應(yīng)體系 (見表2)。

表2 巢式PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

1.3.4 巢式PCR實驗 根據(jù)引物設(shè)計參數(shù)確定最佳反應(yīng)條件如下:引物P1/P2:第一輪94℃ 6分鐘;94℃ 30秒，60℃ 5秒，74℃ 30秒，40個循環(huán);74℃ 6分鐘。引物P3/P4:第二輪94℃ 6分鐘;94℃ 30秒，55℃ 5秒，74℃ 26秒，40個循環(huán);74℃ 6分鐘。

按照表2中的反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果，配制巢式PCR反應(yīng)緩沖液。50μl反應(yīng)體系包含對應(yīng)濃度的上述試劑和5μl DNA模板。

1.3.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物 取5.5μl PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測目的條帶是否存在及其亮度。將產(chǎn)物電泳結(jié)果陽性的樣本，送測序公司，進(jìn)行焦磷酸測序。

1.3.6 測序結(jié)果的序列比對 將測序結(jié)果中，seq格式序列與NCBI上下載的HBV標(biāo)準(zhǔn)野生毒株序列用Mega 4.0進(jìn)行比對，從而得到巢式PCR反應(yīng)的最低檢測濃度。將測序結(jié)果的ab1格式文件，用Chromas軟件對其中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA的測序情況進(jìn)行分析，檢查是否出現(xiàn)重疊峰，是否發(fā)生突變，驗證質(zhì)粒DNA純度及PCR產(chǎn)物的特異性。

1.3.7 臨床樣本的檢測 對223例CHB患者進(jìn)行巢式PCR檢測，同時以熒光定量PCR反應(yīng)對其病毒載量定量。將測序結(jié)果的 seq格式文件中的序列復(fù)制到 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi可得到HBV分型結(jié)果。將ab1格式文件用Mega 4.0與HBV標(biāo)準(zhǔn)序列片段進(jìn)行比對可得到HBV耐藥突變結(jié)果。對用藥組和未用藥組結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，評估核苷類似物治療對患者體內(nèi)HBV病毒變異的影響。

2 結(jié)果

2.1 巢式PCR產(chǎn)物檢測下限 本實驗通過巢式PCR技術(shù)，利用兩對引物成功擴(kuò)增出HBV P基因RT區(qū)長約755bp，B/C型標(biāo)準(zhǔn)病毒DNA都能由P引物成功擴(kuò)增出陽性條帶。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA用引物經(jīng)兩輪約4小時巢式PCR擴(kuò)增后，質(zhì)粒DNA濃度由2×105copies/ml至2×103copies/ml者均在設(shè)計長度位置有可見的明亮陽性條帶;濃度為2×102copies/ml時有隱約的可見條帶 (圖1、圖2)，但送測序后，均顯示反應(yīng)弱，測序失敗。故初步確定2×103copies/ml為巢式PCR反應(yīng)的檢測下限。

圖1 質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)HBV巢式PCR產(chǎn)物電泳圖(1～4為2×105copies至2×102copies質(zhì)粒，5、6為B、C型標(biāo)準(zhǔn)HBV DNA)

圖2 HBV巢式PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 測序結(jié)果分析及序列比對 標(biāo)準(zhǔn)病毒DNA、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA測序結(jié)果均未出現(xiàn)重疊峰現(xiàn)象，測序結(jié)果良好，表明實驗中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和污染現(xiàn)象。B/C型標(biāo)準(zhǔn)病毒測序結(jié)果于美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分型均與其對應(yīng)的型別相符 (圖3)。濃度為2×105copies/ml至 2×103copies/ml的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果良好，且條帶長度基本與設(shè)計相符。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)病毒DNA測序結(jié)果

2.3 巢式PCR反應(yīng)結(jié)合焦磷酸測序技術(shù)的臨床應(yīng)用 利用本巢式PCR反應(yīng)結(jié)合焦磷酸測序體系，進(jìn)行的臨床應(yīng)用的初步探索，將223例慢性乙肝患者分為用藥組和未用藥組，選取RT中的8個位點 (rt173L、rt180M、rt181V、rt184G/I/S、rt202I/G、rt204I/V/S、rt236T、rt250V/L)作為靶位點分析。所有樣本均能通過巢式PCR擴(kuò)增出陽性條帶，并成功測序。在用藥組192例中，53例 (27.6%)患者發(fā)生耐藥突變，其中30.1%(16例)發(fā)生204位點突變，產(chǎn)生180位點、181耐藥突變的均為5.6%(3/53)，3.8%(2/53)發(fā)生236位點突變，1.9%(1/53)發(fā)生202位點突變;37.7(20/53)同時產(chǎn)生180/204位點突變，同時發(fā)生181/236、204/250位點突變的均為3.8%(2/53);同時發(fā)生3個位點突變的占7.5%(173/180/240、180/181/204、180/184/204、180/202/204各1例)。用藥組患者的測序進(jìn)行基因分型表明153例(79.7%)為B型HBV，39例 (20.3%)為C型HBV。上述突變中，204位點突變往往伴隨著180位點的同時突變 (24例，占突變患者的45.3%)(圖4)。未用藥組31例中，未發(fā)現(xiàn)耐藥突變的現(xiàn)象，基因分型結(jié)果表明25例 (80.6%)為B型HBV，6例 (19.4%)為C型HBV。

圖4 180、204位點突變測序結(jié)果(箭頭指示突變堿基)

3 討論

當(dāng)前對CHB的治療主要是采用核苷 (酸)類似物和干擾素進(jìn)行抗病毒治療，核苷 (酸)類似物盡管具有強(qiáng)大的HBV DNA抑制作用、能方便地口服給藥、不良反應(yīng)也較干擾素少等優(yōu)點，但選擇其作為首選治療策略的病患須面對長期用藥和逐年增高的耐藥風(fēng)險的現(xiàn)實［1，3～6］。

現(xiàn)階段針對CHB耐藥的檢測主要有基因型耐藥和表型耐藥兩種［1，6］。當(dāng)病毒對某些藥物產(chǎn)生耐藥性時，病毒基因會發(fā)生一些明確的突變，且基因型耐藥往往在表型耐藥前1～3個月出現(xiàn)。因此，在臨床治療過程中對HBV進(jìn)行耐藥基因型的檢測，將有助于幫助醫(yī)生及時給出或調(diào)整治療方案，延緩或阻止表型耐藥的發(fā)生?；蛐湍退帣z測方法目前常用的有直接測序法、限制性片段多態(tài)性分析法、線性探針反向雜交、基因芯片法4種。直接測序法又是其中最為直觀的，且能同時檢測多個耐藥突變位點。

本研究所建立的巢式PCR結(jié)合焦磷酸測序技術(shù)的HBV耐藥突變檢測方法中，能對B/C型HBV DNA進(jìn)行良好的擴(kuò)增、測序。在對少量臨床樣本的初步探索中，只檢測到B型、C型HBV，且B型居多，與湖北地區(qū)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)基本相符［7，8］。研究中針對拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、恩曲他濱和阿德福韋酯5種核苷 (酸)類似物的突變位點檢測，顯示204位點由野生型的M突變?yōu)閅IDD和YVDD的明顯高于其他位點的突變，且180位點突變往往同時突變，這可能與臨床上對拉米夫定和恩替卡韋兩種藥物的大量使用有關(guān)［1，2］。

本檢測技術(shù)能進(jìn)行HBV多個耐藥位點的檢測，還能同時進(jìn)行病毒基因分型，為治療藥物的選用、調(diào)整和療效判斷提供重要的依據(jù)。巢式PCR方法不需要特殊的檢測儀器和昂貴的進(jìn)口試劑，操作簡單快捷;即使不具備焦磷酸測序條件的普通臨床實驗室也可聯(lián)合商業(yè)測序公司完成HBV分型和耐藥突變位點的檢測，適合臨床推廣使用。

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