馮翠蘭，劉富來

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山528231）

緩慢葡萄球菌屬于凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulase－negative staphylococci，CNS）。該菌被 Kloos等（1976）命名為松鼠葡萄球菌緩慢亞種（Staphylococcus sciurisubsp．lentus）［1］，并 由 Schleifer K H 等［2］（1983）將其劃分為葡萄球菌屬的1個(gè)獨(dú)立的種，即緩慢葡萄球菌（S．lentus）。CNS曾被認(rèn)為不具有致病性，但越來越多的資料表明，CNS是人類或許多動(dòng)物不可忽視的致病菌，可引起人類疾病并在醫(yī)院感染中占據(jù)重要地位，尤其對(duì)于新生幼兒、存在嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病或長期接受醫(yī)院治療的病人等免疫力低下的人群更容易導(dǎo)致嚴(yán)重的后果［3］。

中草藥在臨床應(yīng)用歷史悠久，但從中草藥中尋找具有抗菌活性成分的研究，一直未能取得明顯的進(jìn)展。經(jīng)初步研究，鴨腳樹葉含豐富的熊果酸和鴨腳樹葉堿等活性成分［4］，熊果酸作為主要成分之一，對(duì)金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌及大腸桿菌等多種細(xì)菌有抑制作用，但未見熊果酸在體內(nèi)外均能抗菌的相關(guān)報(bào)道。中藥配伍理論是中醫(yī)藥理論的精華之一，開展方劑配伍規(guī)律的現(xiàn)代研究對(duì)于繼承和發(fā)展中藥配伍理論具有重要理論意義，本研究將鴨腳樹葉提取物與青霉素配伍，應(yīng)用于小鼠試驗(yàn)性緩慢葡萄球菌病的防治試驗(yàn)，為篩選適合臨床治療緩慢葡萄球菌病的藥劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要試劑和菌種 鴨腳樹葉提取物，佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備，中山大學(xué)分析測試中心檢測，熊果酸含量為93．3%［4］；青霉素，純度≥96．0%，上海瑞康動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供；S．lentus（編號(hào)為SL01）由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室自瀕死病豬分離，并由廣東省微生物分析測試中心鑒定（［2010］SP1170）［5］。

1．2 試驗(yàn)動(dòng)物 18日齡～22日齡SPF小鼠，雌雄各半，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)至體質(zhì)量30±6g用于試驗(yàn)，試驗(yàn)前禁飼12h。

1．3S．lentus致小鼠發(fā)病模型的建立

1．3．1 菌液制備 挑取生長在LB平板上的S．lentus單菌落，接種于5mL營養(yǎng)肉湯中37℃搖振（100r／min）培養(yǎng)20h，然后轉(zhuǎn)移至95mL新鮮液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，收集培養(yǎng)物，同時(shí)采用平板表面涂布法和YLN－30電腦控制菌落計(jì)數(shù)器進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，調(diào)整所收集S．lentus培養(yǎng)物含菌量，使其濃度為9．6×109CFU／mL。

1．3．2S．lentus致小鼠發(fā)病模型的建立 將小鼠隨機(jī)分為4組，每組11只。1組～3組為染菌方式試驗(yàn)組，依次為第1組腹腔注射、第2組肌肉注射、第3組灌胃口服，各組染菌劑量均為0．5mL（9．6×109CFU／mL）；第4組為對(duì)照組，腹腔注射0．5mL滅菌生理鹽水。感染后定期觀察并記錄小鼠的發(fā)病情況。無菌采集死亡小鼠組織臟器進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)死亡率和細(xì)菌分離情況。

1．4S．lentus對(duì)小鼠感染劑量試驗(yàn) 將小鼠稱重標(biāo)記，隨機(jī)分為7組，每組11只。1組～6組為試驗(yàn)組，分別經(jīng)腹腔注射含菌量為9．6×108CFU／mL～9．6×103CFU／mL的S．lentus培養(yǎng)液0．5mL；第7組為對(duì)照組，腹腔注射等體積滅菌生理鹽水。以死亡率小于100%的最小稀釋度作為預(yù)防和治療試驗(yàn)的感染菌液。

1．5 鴨腳樹葉提取物和青霉素中西合劑對(duì)試驗(yàn)性小鼠緩慢葡萄球菌病的防治試驗(yàn)

1．5．1 體外抑菌試驗(yàn) 鴨腳樹葉提取物與青霉素按質(zhì)量比為2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3的比例混合，用15%甲醇配制混合物含量為1 000μg／mL的溶液，二倍稀釋法稀釋至含量為3．9μg／mL的10mL培養(yǎng)基試管中，分別加入0．1mL（9．6×107CFU／mL）SL01菌株培養(yǎng)液，置于搖床上，37℃100r／min下培養(yǎng)24h，將加藥SL01菌株培養(yǎng)液接種平板，觀察菌落生長情況，細(xì)菌不生長的最高稀釋度為該混合物的最低抑菌濃度，尋找兩種藥物的最佳配比。

1．5．2 治療試驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分成7組，每組33只。對(duì)照組腹腔注射0．5mL生理鹽水，其余各組每只小鼠按4．8×107CFU 的量腹腔注射0．5mL緩慢葡萄球菌菌液染毒。鴨腳樹葉提取物與青霉素按質(zhì)量比為2∶3混合配制的中西合劑，高、中劑量試驗(yàn)組劑量分別為150mg／kg體重、100mg／kg體重，低劑量試驗(yàn)組、鴨腳樹葉提取物對(duì)照組和青霉素對(duì)照組的劑量均為50mg／kg體重。染毒后出現(xiàn)首例發(fā)病小鼠時(shí)，灌胃口服各種對(duì)應(yīng)劑量藥液0．5mL，每天上午、下午各1次，連用5d，健康對(duì)照組和感染對(duì)照組給予等量生理鹽水，觀察至連續(xù)7d不出現(xiàn)新病例為止，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)和保護(hù)率。

1．5．3 預(yù)防保護(hù)試驗(yàn) 將小鼠隨機(jī)分成7組，每組33只。高、中劑量試驗(yàn)組劑量為120mg／kg體重、80mg／kg體重，低劑量試驗(yàn)組、鴨腳樹葉提取物對(duì)照組和青霉素對(duì)照組的劑量均為50mg／kg體重。每天灌胃口服各種對(duì)應(yīng)劑量鴨腳樹葉提取物與青霉素按質(zhì)量比為2∶3混合配制的中西合劑0．5mL，對(duì)照組不添加藥物，至試驗(yàn)結(jié)束。投藥后的第4天開始，試驗(yàn)組和感染對(duì)照組每只小鼠按4．8×107CFU的量腹腔注射S．lentus菌液染毒。觀察至連續(xù)7d不出現(xiàn)新病例為止，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)和保護(hù)率。

2 結(jié)果

2．1 小鼠發(fā)病模型的試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)腹腔和肌肉注射，S．lentus（SL01）均可導(dǎo)致小鼠沉郁，流淚，繼而出現(xiàn)昏睡，身體蜷縮變形，至第6天～第18天間全部死亡，并由死亡小鼠各臟器中分離到S．lentus。而灌胃口服未導(dǎo)致小鼠明顯的臨床癥狀和死亡，表明染菌方式對(duì)S．lentus的致病性具有一定影響。對(duì)照組小鼠未見異常癥狀。

2．2S．lentus對(duì)小鼠感染劑量試驗(yàn)結(jié)果 每只小鼠腹腔注射含菌量為9．6×109CFU／mL菌液0．5 mL，每只小鼠染菌量≥4．8×106CFU即可引起小鼠感染死亡（表1）。

表1 S．lentus腹腔注射對(duì)小鼠的感染劑量的試驗(yàn)

2．3 鴨腳樹葉提取物和青霉素中西合劑對(duì)試驗(yàn)性小鼠緩慢葡萄球菌病的防治效果

2．3．1 體外抑菌效果 鴨腳樹葉提取物和青霉素及兩者混合物均有一定的抗菌活性。鴨腳樹葉提取物與青霉素按質(zhì)量比為2∶3混合后的抗菌活性最高，提示鴨腳樹葉提取物與青霉素配伍產(chǎn)生了協(xié)同作用（表2）。

表2 鴨腳樹葉提取物和青霉素及配伍制劑的體外抑菌試驗(yàn)

2．3．2 治療效果 鴨腳樹葉提取物對(duì)照組（A）和青霉素對(duì)照組（B）降低死亡率均為42．5%，鴨腳樹葉提取物與青霉素中西合劑高、中、低劑量組降低死亡率均大于48．5%，各組均能有效控制感染小鼠的臨床癥狀，極顯著降低死亡率（P＜0．01）（表3）。

表3 鴨腳樹葉提取物與青霉素混合物治療試驗(yàn)性緩慢葡萄球菌病小鼠的試驗(yàn)

2．3．3 預(yù)防效果 鴨腳樹葉提取物與青霉素中西合劑高劑量組和中劑量組均全部存活，低劑量組死亡率為9．1%，鴨腳樹葉提取物對(duì)照組（A）和青霉素（B）對(duì)照組死亡率分別為15．2%和12．2%，而感染對(duì)照組死亡率為63．6%。各組均明顯降低了死亡率，與感染對(duì)照組比較差異均極顯著（P＜0．01）。表明應(yīng)用鴨腳樹葉提取物與青霉素混合物預(yù)防緩慢葡萄球菌病時(shí)，劑量達(dá)80mg／kg以上即可取得可靠的效果（表4）。

表4 鴨腳樹葉提取物與青霉素混合物對(duì)小鼠試驗(yàn)性緩慢葡萄球菌病的預(yù)防保護(hù)試驗(yàn)

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)腹腔注射可復(fù)制出典型的緩慢葡萄球菌病例，當(dāng)每只小鼠感染劑量達(dá)4．8×106CFU即可能引起小鼠感染死亡，這與盛相鵬等認(rèn)為該菌具較強(qiáng)致病力的觀點(diǎn)類似［3］。

鴨腳樹葉提取物與青霉素混合物（質(zhì)量比2∶3）對(duì)S．lentus具有較強(qiáng)的抑制作用，且抗菌能力與藥物濃度具正相關(guān)性。鴨腳樹葉提取物與青霉素混合物的劑量達(dá)到80mg／kg體重時(shí)可較好地保護(hù)小鼠免受病原侵襲，提示鴨腳樹葉提取物與青霉素混合物用于治療緩慢葡萄球菌病可獲良好效果，鴨腳樹葉提取物與青霉素中西合劑中各組分沒有明顯相互拮抗作用，顯示鴨腳樹葉提取物與青霉素混合物對(duì)防治S．lentus病具良好的應(yīng)用前景。

細(xì)菌引起的疾病是養(yǎng)殖業(yè)一大危害，而抗生素的長期濫用導(dǎo)致耐藥菌株的種類越來越多，因此，急需研制既可有效防治細(xì)菌病、藥理作用機(jī)制明確，又能替代抗生素的新型中藥制劑。以中藥材中活性成分作為配伍對(duì)象，將藥物配伍改為組分配伍制成的鴨腳樹葉提取物與青霉素中西合劑，其高、中、低劑量組降低死亡率的效果與感染對(duì)照組比較差異均極顯著（P＜0．01），一定程度印證了中藥配伍理論和中藥組分學(xué)的科學(xué)性，為臨床篩選治療緩慢葡萄球菌病藥物制劑提供試驗(yàn)依據(jù)，但對(duì)于S．lentus的致病機(jī)理以及鴨腳樹葉提取物與青霉素混合物的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

［1］ Kloos W E，Schleifer K H，Smith R F．Characterization ofStaphylococcussciurisp nov and its subspecies［J］．Int J Syst Bacteriol，1976，26：22－37．

［2］ Schleifer K H，Geyer U，Kilpper－Balz R，etal．Elevation ofStaphylococcussciurisubsp．lentus（Kloos，etal．）to speciesstatus：Staphylococcuslentus（Kloos，etal．）comb Nov［J］．Syst Appl Microbiol，1983，4：382－387．

［3］ 盛相鵬，杜崇濤，許會(huì)會(huì)，等．倉鼠源緩慢葡萄球菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究［J］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（7）：30－35．

［4］ 馮翠蘭，潘帶卿，劉嬡姬．從鴨腳樹葉中提取熊果酸的初步研究［J］．科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào)，2011，32：4－5．

［5］ 劉富來，馮翠蘭．豬源緩慢葡萄球菌的分離鑒定及致病性研究［J］．中國動(dòng)物檢疫，2011（4）：56－58．