劉克祥，管延杰，趙樹臣，范宏剛，侯振中

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

硒是生物體必需的微量元素之一，分布廣泛，主要通過食物鏈控制著動物的硒營養(yǎng)狀況。研究表明，硒具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫、參與雄性激素的代謝以及拮抗多種微量元素的毒性等作用。但硒的攝入過量會導(dǎo)致毒性作用。本試驗通過對小鼠給予過量的亞硒酸鈉制作亞急性硒中毒動物模型，研究了亞急性硒中毒對小鼠睪丸能量代謝及抗氧化能力的影響，為獸醫(yī)臨床合理補硒和預(yù)防硒中毒提供用藥參考。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1．1．1 試驗動物 體重20±2g（5～6周齡）的昆明系未交配過的健康小鼠200只（雌性40只、雄性160只）。

1．1．2 主要儀器 XHF－1內(nèi)切式勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；PS－9000705超純水制備裝置（美國Millpore科技有限公司）；752N型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）。

1．1．3 主要試劑 亞硒酸鈉（Sodium Selenite），分析純，批號：20090313，購自上海三浦化工有限公司。1．1．4 樣品的制備 將70只小鼠隨機分成7個組，每組10只，利用改良寇氏法［1］計算出亞硒酸鈉對小鼠的LD50＝10．8mg／kg體重。另取120只雄性昆明系小鼠按照1／5LD50（2．16mg／kg體重）、1／20LD50（0．54mg／kg體重）、1／80LD50（0．14mg／kg體重）和相同體積的生理鹽水4種給藥劑量隨機分成高、中、低劑量組和對照組，每天上午同一時間給藥，連續(xù)30d。所有小鼠分別于給藥10、20、30d時分3批處死，處死后采取小鼠的睪丸組織勻漿后，離心取上清，－80℃保存。

1．2 試驗方法

1．2．1 睪丸LDH活性檢測 乳酸脫氫酶（LDH）能催化乳酸生成丙酮酸，與2，4－二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性環(huán)境中呈棕紅色，通過比色可求出該酶的活力。

1．2．2 小鼠睪丸SOD活性檢測 機體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基可氧化羥胺形成亞硝酸鹽，顯色劑作用下呈紫紅色，當(dāng)被測樣品中含SOD時，則對其有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力。

1．2．3 小鼠睪丸MDA含量檢測 采用硫代巴比妥酸法。酸性條件下脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）受熱后，與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)，形成粉紅色化合物，該化合物在532nm處有最大吸收峰，由此求得反應(yīng)體系的MDA含量。

2 結(jié)果與分析

小鼠睪丸能量代謝及抗氧化能力 由表1可知，各個時間點各染毒組小鼠睪丸LDH活性分別與對照組比較差異顯著（P＜0．05）或極顯著（P＜0．01）。低劑量組不同時間點之間兩兩比較差異不顯著（P≥0．05），中、高劑量組10d與20d比較差異不顯著（P≥0．05），分別與30d比較差異顯著（P＜0．05）。表明硒染毒后，小鼠睪丸LDH活性明顯降低，隨著染毒劑量的增加呈顯著下降趨勢，隨著染毒時間的延長下降趨勢不顯著。

表1 不同染毒劑量與染毒時間睪丸LDH活性檢測 （U／gprot）

圖1 不同染毒劑量與染毒時間睪丸LDH活性比較

由表2可知，10d時，低、中劑量組小鼠睪丸SOD活性與對照組比較差異不顯著（P≥0．05），高劑量組與對照組比較差異顯著（P＜0．05）；20d和30d時，各染毒劑量組分別與對照組比較以及各染毒劑量組之間比較差異顯著（P＜0．05）或極顯著（P＜0．01）。各染毒劑量組不同時間點之間比較差異顯著（P＜0．05）或極顯著（P＜0．01）。表明硒染毒后，小鼠睪丸細胞SOD活性明顯降低，隨著染毒劑量的增加和染毒時間的延長呈顯著下降趨勢。

由表3可知，10d時，低、中劑量組小鼠睪丸MDA含量與對照組比較差異不顯著（P≥0．05），高劑量組與對照組比較差異顯著（P＜0．05）；20d和30d時，各劑量組分別與對照組比較以及各劑量組之間比較均為差異顯著（P＜0．05）或極顯著（P＜0．01）。各劑量組不同時間點之間比較均為差異極顯著（P＜0．01）。表明硒染毒后，小鼠睪丸細胞MDA含量明顯升高，隨著染毒劑量的增加和時間的延長呈顯著升高趨勢。

3 討論

乳酸脫氫酶（LDH）由生精細胞產(chǎn)生，廣泛存在于生精小管內(nèi)，動物睪丸各級生精細胞位于支持細胞緊密連接的上方，很難直接通過基膜從間質(zhì)獲取營養(yǎng)，而主要依靠自身糖酵解獲取細胞所需能量，因此乳酸脫氫酶是生精細胞糖代謝生能的主要酶，它對于生精細胞的增殖分裂以及分化過程中的能量代謝都起著重要作用。若其合成減少或其活性受到抑制，將阻礙能量的供給，最終有可能導(dǎo)致細胞的變性或者凋亡，因此LDH的含量和活性的動態(tài)變化可作為評價生殖毒性的敏感指標(biāo)之一。LDH活性還與生精過程及精子活動、獲能及受精有關(guān)，可作為預(yù)測生精能力的重要指標(biāo)［2］。本試驗結(jié)果顯示，硒染毒后，小鼠睪丸LDH活性顯著降低，隨著染毒劑量的增加，LDH活性呈明顯的下降趨勢，即呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，提示硒可能通過引起生精細胞的損傷而抑制LDH的分泌或其活性，也可能直接作用于LDH對其活性造成影響。LDH活性降低表明硒或其代謝產(chǎn)物對機體具有毒性作用，阻礙生精細胞能量供應(yīng)和營養(yǎng)供給，影響精子的發(fā)生，使各級生精細胞數(shù)量減少。

表2 不同染毒劑量與染毒時間睪丸SOD活性檢測 （U／mgprot）

表3 不同染毒劑量與染毒時間睪丸MDA含量檢測 （nmol／mgprot）

超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于生物體中，是機體脂質(zhì)過氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶。其主要功能為催化生物體內(nèi)超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，特異性清除體內(nèi)氧自由基，終止自由基連鎖反應(yīng)，從而保護生物膜免受自由基的攻擊。SOD在防御氧自由基毒性、抗輻射損傷、預(yù)防衰老以及治療腫瘤和炎癥等方面起著重要作用，SOD活性的改變可以作為機體組織受到氧化損傷的一項敏感的生物學(xué)指標(biāo)。

丙二醛（MDA）是ROS攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸（PUMA）形成的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，可以造成組織的損傷，因此用來反映組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。MDA能夠與膜脂質(zhì)或蛋白上的游離氨基酸交聯(lián)而改變膜的結(jié)構(gòu)，氧化琉基、使酶失活，引起磷酯酰膽堿和磷酯酰絲氨酸交聯(lián)，干擾膜的離子轉(zhuǎn)運功能，從而干擾細胞的正常功能［3］。

趙紅剛等［4］探討亞硒酸鈉對不同器官、組織SOD活性的影響，結(jié)果顯示肝、腎、心等器官SOD活性隨著亞硒酸鈉染毒劑量的增加逐漸降低。本試驗中，隨著硒染毒劑量的增加，小鼠睪丸SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高，各劑量組與對照組比較差異顯著。該結(jié)果表明，硒能夠破壞睪丸的過氧化防御系統(tǒng)，引起睪丸組織的脂質(zhì)過氧化損傷，同時生產(chǎn)大量脂質(zhì)過氧化物，其中的MDA促進ROS轉(zhuǎn)化成非自由基性的脂類分解產(chǎn)物，通過鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)放大ROS的氧化損傷作用，使生物膜損傷更加嚴(yán)重［5］，最終引起細胞膜破裂、內(nèi)容物釋放等，造成睪丸組織結(jié)構(gòu)與功能的損傷，與睪丸組織學(xué)切片結(jié)果相一致。

［1］ 沈建忠．動物毒理學(xué)［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：90－94．

［2］ Sinha N，Narayan R，Saxena D K．Effect of endosuifan on the testis of growing rats［J］．Bull Environ Contam Toxieol，1997：58：79－86．

［3］ 孫存晉，張建中，段紹瑾．自由基生物學(xué)導(dǎo)論［M］．合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，1999：150－156．

［4］ 趙紅剛，陳賢均．硒中毒對小鼠器官蛋白質(zhì)含量及SOD活性影響的實驗研究［J］．環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2006，23（3）：262－263．

［5］ 段麗菊．甲醛致雄性小鼠的氧化損傷和雄性生殖遺傳毒的研究［D］．武漢：華中師范大學(xué)，2005．