陳雪龍，吳海燕，王忠偉，郭 麗，齊艷萍，2

（1．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶163319；

2．農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（大慶），黑龍江 大慶163319）

新城疫病毒（NDV）是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病病原，曾經(jīng)對全球養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。過去一般認(rèn)為水禽對NDV的易感性較差，多呈隱性感染［1］。然而自20世紀(jì)90年代以來，國內(nèi)外愈來愈多的報(bào)道顯示NDV對水禽的致病力逐漸增強(qiáng)，鵝、鴨等水禽已成為易感禽類［2］。

2012年5月，黑龍江大慶某大雁養(yǎng)殖場的大雁（后鑒定為鴻雁）中發(fā)生了以輕微呼吸道癥狀和稀便、腿麻痹、站立不穩(wěn)等為主要癥狀的疾病，使用多種抗生素治療無效。為了查明發(fā)病原因，采集了發(fā)病大雁病料，進(jìn)行了病原分離鑒定工作。

1 材料與方法

1．1 主要試劑及試驗(yàn)動(dòng)物 TRIzol試劑、M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTP，購自Invitrogen公司；ExTaqDNA 聚合酶、DNA Marker（DL－2 000），購自寶生物工程（大連）有限公司。NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、H5、H9亞型禽流感病毒（AIV）標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、減蛋綜合征病毒（EDSV）標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；陰性血清，購自瑞普生物藥業(yè)有限公司。PBS、1%雞紅細(xì)胞、雙抗（濃度為4 000IU（μg）／mL的青霉素與鏈霉素）按常規(guī)方法本實(shí)驗(yàn)室自制。

實(shí)驗(yàn)用1日齡及6周齡SPF雛雞和10日齡的SPF雞胚，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．2 病料處理 現(xiàn)場采集大慶某大雁養(yǎng)殖場發(fā)病鴻雁（Ansercygnoides）的腦、脾、肺、腸等組織。其后于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將病料剪碎研磨，用滅菌PBS按照體積比1∶4制備懸液，反復(fù)凍融3次后，8 000r／min離心10min，取上清加入雙抗，37℃作用1．5h，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 病毒分離與血清學(xué)鑒定 將病理處理后的上清液接種雞胚，每胚接種200μL，共接種4個(gè)10日齡SPF雞胚，每天照蛋3次，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，收獲36～96h死亡雞胚的尿囊液進(jìn)行血液凝集試驗(yàn)（HA），若有血凝性再與NDV陽性血清、AIV陽性血清（H5／H9）和EDSV陽性血清進(jìn)行血凝抑制（HI）試驗(yàn)，操作方法按文獻(xiàn)［3］方法進(jìn)行。

1．4 分離株F基因RT－PCR鑒定

1．4．1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank中發(fā)表的鴨NDVF基因序列設(shè)計(jì)一對通用引物，用于擴(kuò)增F基因，序列如下：上游引物 P1：5′－GAGGTTACCTCYACYAAGCTRGAGA－3′，下游引物P2：5′－TCATTAACAAAYTGCTGCATCTTCCCWAC－3′，預(yù)計(jì)目的擴(kuò)增片段為535bp。

1．4．2 RT－PCR反應(yīng) 取尿囊液，按照 TRIzol試劑說明提取病毒RNA，加入適量的DEPC處理水溶解。在 PCR 管中加入 RNA 10．5μL，10μmol／L dNTP 2μL，20μmol／L 上游引物2μL，5×RT Buffer 4μL，40U／μL RNasin 0．5μL；200U／μL M－MLV 1μL，反應(yīng)總體積20μL，混勻在42℃水浴中作用1．5h。PCR反應(yīng)體系采用25μL體系，模板cDNA 3μL，10×Buffer 3μL，F(xiàn)1、F2 引物各1 μL，dNTP 3μL，Ex－TaqDNA聚合酶1μL，DEPC水13μL。PCR反應(yīng)條件為95℃3min，94℃40s，54℃30s，72℃1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min，最后取PCR產(chǎn)物5μL，在10g／L瓊脂糖凝膠上電泳觀察結(jié)果。

1．5 NDV致病指數(shù)測定 參照文獻(xiàn)［4］方法進(jìn)行致死雞胚平均死亡時(shí)間（MDT）、1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）和6周齡雛雞靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）等NDV致病指數(shù)的測定。

1．5．1 MDT的測定 將尿囊液用滅菌PBS作10倍稀釋成10－6～10－10，每個(gè)稀釋度經(jīng)尿囊腔接種6個(gè)10日齡SPF雞胚，0．1mL／個(gè)，置37℃培養(yǎng)，棄去24h內(nèi)死亡雞胚，每日照蛋3～4次，連續(xù)觀察7d，記錄使所有雞胚死亡的最高稀釋度致死雞胚的平均時(shí)間（MDT）。

1．5．2 ICPI的測定 用滅菌PBS（1∶10）稀釋病毒尿囊液，接種10只1日齡的非免疫雛雞，每只腦內(nèi)接種0．05mL。每天在與接種相應(yīng)的時(shí)間觀察雞群的健康狀況，并對試驗(yàn)雞進(jìn)行評定：正常記0分，發(fā)病記1分，死亡記2分。連續(xù)觀察8d，最后計(jì)算ICPI。

1．5．3 IVPI的測定 將分離株尿囊液以PBS稀釋10倍，翅靜脈接種6周齡SPF雞10只，0．1 mL／只，每天在與接種相應(yīng)的時(shí)間檢查雞群的健康狀況，連續(xù)觀察10d。記錄正常、發(fā)病、麻痹與死亡雞的每日累計(jì)數(shù)，最后計(jì)算IVPI。

2 結(jié)果

2．1 鴻雁臨床癥狀及剖檢變化 現(xiàn)場觀察病雁表現(xiàn)一定程度的精神不振，食欲和飲水減少；鼻孔流出少量清亮水樣液體，張口伸頸呼吸；腹瀉，排白色、黃色或黃白色稀便；翅膀下垂，雙腿輕微麻痹無力，站立不穩(wěn)或者不愿行走。

經(jīng)剖檢觀察：腹段食管黏膜有白色壞死點(diǎn)；腸黏膜嚴(yán)重壞死脫落并伴有較為嚴(yán)重的出血；脾臟色暗紅并腫大，可見不規(guī)則的灰白色壞死點(diǎn)；肺臟表面有纖維素性滲出物形成纖維性假膜；肝臟邊緣散在有針尖大出血點(diǎn)和黃白色壞死點(diǎn)，膽囊壁增厚并擴(kuò)張；腺胃乳頭有出血點(diǎn)，與肌胃交界處出血或有潰瘍灶；心外膜和心內(nèi)膜均有出血點(diǎn)，并有白色壞死灶；腦輕微水腫、充血；其他組織或器官無肉眼可見病變。

2．2 病毒的分離與初步鑒定結(jié)果 雞胚接種后，大多數(shù)在接種后45～70h死亡，胚體有出血現(xiàn)象，尤其胚體的頭、頸和爪出血嚴(yán)重。收集死亡雞胚的尿囊液，HI試驗(yàn)測得死亡雞胚的尿囊液均具有血凝價(jià)（6～9lb）。分離株的這種血凝性可被NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所抑制，而不能被流感 H5、H9亞型AIV和EDSV陽性血清所抑制，說明分離毒為NDV，命名為DQBT01。

2．3 分離株F基因RT－PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果 對病毒尿囊液進(jìn)行F基因的RT－PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，檢測結(jié)果如圖1所示：

圖1 NDV F基因RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果

如圖1所示，對照DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，NDV特異性檢測引物的擴(kuò)增片段長度為535bp，擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)計(jì)片段大小相同，因此可以進(jìn)一步判斷此分離毒為NDV。

2．4 NDV的致病指數(shù)測定結(jié)果

2．4．1 MDT的測定結(jié)果 分離毒株尿囊液接種10日齡SPF雞胚后的死亡情況見表1，從表中可見，引起全部雞胚致死的最高稀釋度為10－8，經(jīng)計(jì)算，MDT為55h。

表1 DQBT01分離株MDT測定

2．4．2 ICPI測定結(jié)果 1日齡雛雞腦內(nèi)接種分離病毒發(fā)病及死亡情況見表2，雛雞接種后2～4d后出現(xiàn)典型癥狀進(jìn)而死亡。雛雞剖檢見腺胃黏膜充血，十二指腸充血、出血。經(jīng)計(jì)算ICPI為1．68。

表2 DQBT01分離株ICPI測定

2．4．3 IVPI測定結(jié)果 6周齡SPF雞靜脈接種分離病毒發(fā)病及死亡情況見表3，接種后第2天雛雞開始出現(xiàn)癥狀并有2只死亡，在接種第四天SPF雞全部死亡，剖檢主要在腺胃和肌胃交界處有出血斑或出血帶，腺胃黏膜腫脹充血。按公式計(jì)算：IVPI為2．54。

表3 DQBT01分離株IVPI測定

3 討論

本試驗(yàn)從發(fā)病死亡的鴻雁體內(nèi)分離得到1株病毒，該病毒可使SPF雞胚出現(xiàn)全身出血性變化，死亡雞胚的尿囊液經(jīng)過血清學(xué)試驗(yàn)以及NDVF基因RT－PCR擴(kuò)增證明該病毒株為 NDV，命名為DQBT01。該病毒MDT、ICPI和IVPI致病指數(shù)分別為55h、1．68、2．54，按照 OLE標(biāo)準(zhǔn)屬于 NDV強(qiáng)毒株。

NDV對鳥類感染宿主范圍比較廣，目前經(jīng)過報(bào)道的野禽已達(dá)200多種［5－7］，一般情況下，野禽在自由生活狀態(tài)下對NDV的有較強(qiáng)的抵抗力，因此所分離的NDV大部分為弱毒株。而在人工飼養(yǎng)條件下，多種野禽可以感染NDV并發(fā)病，其涉及的公共衛(wèi)生問題也受到了高度關(guān)注。目前在我國越來越多的野禽感染NDV并且發(fā)病的報(bào)道越來越多［8］，涉及的物種也開始增多，大雁感染NDV并且發(fā)病的報(bào)道也有少量報(bào)道［9］，而前人認(rèn)為水禽對于NDV可以攜帶而不發(fā)病，因此認(rèn)為水禽對NDV有較強(qiáng)的抵抗力。然而，隨著鵝、鴨、大雁等水禽感染NDV并且發(fā)病的報(bào)道逐漸增多，說明在我國NDV的致病性有增強(qiáng)的趨勢［10］。同時(shí)NDV在野禽和家禽間存在相互感染并傳播的現(xiàn)象，并且在相互傳遞的過程隨著宿主免疫系統(tǒng)的選擇壓力不同，NDV存在著一定程度的變異，這種變異可能導(dǎo)致毒力變強(qiáng)，而這種變異趨勢已引起研究者的高度關(guān)注，如有研究報(bào)道，野禽中自然存在的無毒力毒株，但當(dāng)其在雞群中傳播時(shí)，則具有變成高致病性病毒的能力［11］，這對于我國的養(yǎng)禽業(yè)是嚴(yán)重的威脅。

本次從鴻雁體內(nèi)分離出NDV強(qiáng)毒株，為野生水禽在人工飼養(yǎng)條件下感染NDV并發(fā)病提供了相關(guān)依據(jù)，提示禽類養(yǎng)殖業(yè)，特別是水禽養(yǎng)殖業(yè)，對于NDV的防疫要引起足夠的重視，這對于我國控制ND的傳播和流行，降低養(yǎng)殖戶的損失具有重要意義。

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