唐雨順，李 林，鄒 晶，李大鵬，藺東啟，姜 勝，范宏剛

（1．錦州醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州121001；2．沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110866；3．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

硫化氫（H2S）作為一種新型氣體信號(hào)分子在自發(fā)性高血壓、慢性阻塞性肺氣腫、膿毒血癥或出血性休克、阿爾茨海默病、肝硬化等多種疾病過(guò)程中及在組織器官缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的病理、生理效應(yīng)。神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性的H2S被認(rèn)為是一種神經(jīng)調(diào)質(zhì)，其可以提高神經(jīng)元NMDA受體調(diào)節(jié)的反應(yīng)，易化海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶；誘發(fā)星形細(xì)胞產(chǎn)生鈣波，從而介導(dǎo)神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞；增加抗氧化劑谷胱甘肽水平、抑制和清除神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的多種氧化性物質(zhì)等，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能有著重要的調(diào)節(jié)和保護(hù)作用［1］。

噻環(huán)乙胺（鹽酸乙胺噻酚環(huán)己酮，Tiletaminehydrochloride），又名替來(lái)他明，為苯環(huán)己哌啶類靜脈全麻藥。將其與唑拉西泮1∶1復(fù)合制成（Telazol合劑），是國(guó)外應(yīng)用于寵物、野生動(dòng)物及試驗(yàn)用小動(dòng)物最為廣泛的復(fù)方麻醉合劑。目前對(duì)其中樞作用機(jī)制已進(jìn)行了系列研究。本試驗(yàn)通過(guò)研究噻環(huán)乙胺麻醉下大鼠不同腦區(qū)內(nèi)源性硫化氫濃度的變化，以探討H2S與麻醉的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料 鹽酸噻環(huán)乙胺，購(gòu)自法國(guó)維克制藥公司（純度99．83%）；DR2800可見(jiàn)光分光光度計(jì)（美國(guó)哈希公司）、VersaMax連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)VersaMax公 司）、AvantiTM30Centrifuge高速冷凍離心機(jī)（Japanese Beckman Company）、202－1A 型恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、微量移液器（芬蘭勃雷公司）；FeCl3·6H2O、3CdSO4·8H2O、對(duì)氨基二甲基苯胺等均為分析純。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 84只180～200日齡Sprague Dawley（SD）大鼠，雌雄各半，體重228±35 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。先隨機(jī)取12只大鼠為對(duì)照組，其余隨機(jī)均分為高、低二個(gè)劑量組，分別腹腔注射噻環(huán)乙胺60、30mg／kg體重，每個(gè)劑量組又隨機(jī)均分為麻醉組、恢復(fù)Ⅰ組和恢復(fù)Ⅱ組3個(gè)亞組。對(duì)照組腹腔注射生理鹽水10 mL／kg體重，5min后斷頭取材，其他組均腹腔注射噻環(huán)乙胺（用前稀釋成10mL／kg體重，以與對(duì)照組等容）。麻醉組在大鼠翻正反射消失后立即斷頭取材，恢復(fù)Ⅰ組在大鼠翻正反射恢復(fù)后斷頭取材，恢復(fù)Ⅱ組在大鼠直線爬行后斷頭取材。

1．2．2 內(nèi)源性硫化氫測(cè)定 斷頭后迅速在生理鹽水冰面上取腦，用4℃生理鹽水將腦上的血跡沖洗干凈，分離雙側(cè)大腦皮層、海馬、小腦、中腦、丘腦，立即液氮冷凍保存，待測(cè)。檢測(cè)時(shí)將分離出來(lái)的腦組織按體重／體積為1／10加入PBS，置于勻漿器中，充分研磨組織使其勻漿化，置于EP管中，3 000r／min（4℃）離心10min，取上清液600μL，加2mmol／L磷酸鉀400μL，使總體積為1mL，放入25mL錐形瓶中進(jìn)行反應(yīng)，加入0．5mL 1%醋酸鋅，用氮?dú)鈱㈠F形瓶充盈30s后石蠟?zāi)し饪?，反?yīng)體系從冰盒轉(zhuǎn)移至37℃水浴搖床開(kāi)始反應(yīng)，90min后向其中加入50%三氯乙酸500μL終止反應(yīng)，繼續(xù)37℃水浴60 min后將錐形瓶?jī)?nèi)內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至含3．5mL蒸餾水的試管中，加20mmol／L對(duì)苯二胺鹽酸鹽500μL，和30mmol／L三氯化鐵400μL，室溫孵育20min后轉(zhuǎn)移至96孔板中，用酶標(biāo)儀于670nm處測(cè)定吸光度。制作H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出溶液中H2S含量［2］。

1．2．3 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD多重分析比較，P＜0．05為差異顯著，P＜0．01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2．1 行為學(xué)變化 低劑量組注藥后大鼠表現(xiàn)較為安靜，逐漸表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩、共濟(jì)失調(diào)、趴臥不動(dòng)，最后翻正反射消失。少數(shù)大鼠有上體晃動(dòng)現(xiàn)象。在麻醉期間部分大鼠有流涎、流淚現(xiàn)象。翻正反射恢復(fù)時(shí)，大鼠呼吸增快，給予一定刺激大鼠可出現(xiàn)體動(dòng)，少數(shù)可斜線爬行或轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)。到大鼠可直線爬行時(shí)，行動(dòng)比較緩慢，極少數(shù)大鼠有復(fù)睡現(xiàn)象。高劑量噻環(huán)乙胺組，翻正反射平均消失時(shí)間、翻正反射平均恢復(fù)時(shí)間及出現(xiàn)直線蘇醒時(shí)間，較低劑量組極顯著增加（P＜0．01）。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大鼠噻環(huán)乙胺麻醉行為學(xué)變化情況（min，±SD，n＝36）

表1 大鼠噻環(huán)乙胺麻醉行為學(xué)變化情況（min，±SD，n＝36）

＊＊：高劑量組與低劑量組比較P＜0．01；＊：P＜0．01或P＜0．05

翻正消失時(shí)間 翻正恢復(fù)時(shí)間 出現(xiàn)直線爬行的時(shí)間低劑量噻環(huán)乙胺2．12±0．19 91．32±14．93 128．43±19．52高劑量噻環(huán)乙胺 1．37±0．24＊＊247．90±33．06＊＊ 361．83±35．40＊＊

2．2 噻環(huán)乙胺對(duì)大鼠不同腦區(qū)內(nèi)源性H2S濃度的影響 大鼠腹腔注射噻環(huán)乙胺30mg／kg體重后，在麻醉組大腦皮層、中腦、海馬的內(nèi)源性H2S濃度明顯降低，分別較對(duì)照組降低了43．01%（P＜0．01）、17．11%（P＜0．05）、23．99%（P＜0．01）。在恢復(fù)I組上述腦區(qū)檢測(cè)指標(biāo)明顯恢復(fù)，與對(duì)照組相比差異不顯著（（P＞0．05））。到恢復(fù)Ⅱ組三腦區(qū)內(nèi)源性H2S濃度基本上恢復(fù)至麻前水平。大鼠腹腔注射噻環(huán)乙胺60mg／kg體重后，在麻醉組大腦皮層、中腦、海馬的內(nèi)源性H2S濃度明顯降低，分別較對(duì)照組降低了58．71%（P＜0．01）、30．80%（P＜0．01）、35．88%（P＜0．01）。而在恢復(fù)Ⅰ組和恢復(fù)Ⅱ組三腦區(qū)的檢測(cè)指標(biāo)逐漸恢復(fù)，到監(jiān)測(cè)結(jié)束除大腦皮層仍低于對(duì)照組（P＜0．01），中腦和海馬H2S濃度基本上恢復(fù)至麻前水平。高低兩劑量組相同腦區(qū)間的H2S濃度進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在大腦皮層、中腦、海馬三腦區(qū)檢測(cè)指標(biāo)變化趨勢(shì)相同，且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。在不同劑量噻環(huán)乙胺麻醉全過(guò)程中小腦和丘腦兩腦區(qū)內(nèi)源性H2S濃度無(wú)明顯變化。結(jié)果見(jiàn)表2。

從試驗(yàn)結(jié)果（表2）可看出，不論是高劑量組還是低劑量組，大腦皮層、中腦、海馬的H2S濃度變化趨勢(shì)與大鼠行為學(xué)變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律，即麻醉時(shí)降低，在蘇醒時(shí)逐漸恢復(fù)，當(dāng)大鼠可以正常運(yùn)動(dòng)時(shí)，基本上恢復(fù)至麻前水平。而小腦和丘腦的H2S濃度變化趨勢(shì)與大鼠行為學(xué)變化相比較，沒(méi)有規(guī)律。

3 討論

H2S最初被認(rèn)為是一種具有臭雞蛋氣味的、無(wú)色有毒氣體。但近些年的研究發(fā)現(xiàn)，H2S存在于大鼠等正常動(dòng)物體內(nèi)，而且在腦脊液內(nèi)能夠檢測(cè)到較高的濃度的H2S［3］。進(jìn)一步的研究報(bào)道表明，H2S能夠通過(guò)一氧化氮（NO）介導(dǎo)的或非NO介導(dǎo)的機(jī)制舒張血管平滑肌、通過(guò)NMDA受體提高神經(jīng)元興奮性和抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、減輕血管重構(gòu)等多種生物學(xué)效應(yīng)?；谏鲜鲅芯?，H2S被認(rèn)為是繼NO、CO后新發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號(hào)分子［4－5］。

表2 噻環(huán)乙胺對(duì)不同腦區(qū)內(nèi)源性H2S濃度的影響 （nmol·g－1，n＝12）

目前國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)麻醉藥物對(duì)不同腦區(qū)內(nèi)源性H2S濃度影響的文獻(xiàn)報(bào)道。噻環(huán)乙胺主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)非特異性NMDA受體，阻斷興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)的NMDA受體是其產(chǎn)生麻醉作用的主要機(jī)制。以往的研究發(fā)現(xiàn)，H2S提高由NMDA受體介導(dǎo)的海馬切片神經(jīng)元對(duì)谷氨酸鹽的反應(yīng)，但不會(huì)引起神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的顯著變化；然而，最近，Nagai等應(yīng)用綠色鈣－1（Calcium Green－1）作為鈣離子敏感的熒光染色Ca2＋成像（calcium imaging）觀察，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的 H2S可以誘發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣波的產(chǎn)生。膠質(zhì)細(xì)胞是通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度及傳遞自發(fā)產(chǎn)生或因不同刺激產(chǎn)生的鈣波這樣的信號(hào)與周圍細(xì)胞進(jìn)行信息交換。局部應(yīng)用H2S能增加神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋的濃度，增加內(nèi)流的Ca2＋，同時(shí)減少細(xì)胞內(nèi)貯存Ca2＋的釋放，誘發(fā)鈣波。由此可見(jiàn)，H2S通過(guò)提高神經(jīng)元對(duì)谷氨酸鹽的反應(yīng)并誘發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生鈣波，從而介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)［6－7］。由此推測(cè)內(nèi)源性 H2S降低，可能抑制細(xì)胞間信息傳導(dǎo)。但其在噻環(huán)乙胺全麻過(guò)程中具體作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

內(nèi)源性H2S可能參與噻環(huán)乙胺麻醉過(guò)程，在大腦皮層、中腦、海馬表現(xiàn)出劑量依賴性、且與大鼠行為性變化具有一定的相關(guān)性。

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