丁 維，賈杏林，芮小慶，申艷輝

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128）

脂質體是一種利用天然材料磷脂和膽固醇制備的類似細胞膜的生物制品，具有良好的生物相容性和靶向性，能降低藥物毒性。在藥學領域脂質體作為類生物膜和藥物載體被廣泛用于實驗研究［1］。利用脂質體包裹血紅蛋白，具有可控制大小，同時脂質體可以屏蔽無基質血紅蛋白的毒副作用，且延長血紅蛋白的血漿半衰期，無紅細胞表面的抗原決定簇，保存時間長達6個月等特點［2－4］。豬紅細胞是來源廣泛的血液代用品制備材料，經(jīng)酶處理后的豬紅細胞和血紅蛋白可多次輸給犬［5－6］，豬紅細胞也用于兔的失血休克的搶救試驗，證明豬紅細胞對兔失血性休克有良好的急救作用［7］。豬源血紅蛋白脂質體是制備動物通用紅細胞的一個比較有前景的方法，可以克服動物血型多、產(chǎn)生的輸血反應和同源輸血導致動物疾病的傳播等妨礙動物臨床輸血發(fā)展的難題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 0.52kg健康貓1只，7.5kg杜長大三元健康仔豬1頭。

1.1.2 藥品與試劑 大豆卵磷脂，膽固醇，氯仿，無菌生理鹽水，肝素。

1.1.3 儀器 BC－2008Vet血液分析儀，Uritest－150型尿液分析儀，超凈工作臺，離心機，顯微鏡，離心管，一次性使用無菌注射器。

1.2 方法

1.2.1 無菌采血 取健康豬血液，抗凝保存。

1.2.2 血紅蛋白的分離及純化 將無菌采取的新鮮豬血經(jīng)脹破法［8］得到血紅蛋白溶液。將得到的上清液依次通過5.0、1.2、0.22μm 微孔濾膜過濾，得到無基質豬血紅蛋白。

1.2.3 脂質體包裹血紅蛋白的制備 200mg大豆卵磷脂和100mg膽固醇充分溶于20mL氯仿中，再加入10mL提純的濃度為133.3g／L的豬血紅蛋白溶液，將混合溶液加入旋轉蒸發(fā)儀中，轉速為90 r／min，減壓旋轉蒸發(fā)加熱，超聲離心，分離和收集人工紅細胞。

1.2.4 輸注前體外配血試驗 取20μL豬血紅蛋白脂質體和40μL貓全血混合，室溫放置15min，肉眼和顯微鏡下觀察紅細胞凝集程度，無凝集反應則可進行輸血。

1.2.5 輸血及貓的各項指標檢查 輸入5mL豬血紅蛋白脂質體，觀察輸血前、中、后貓體溫、心跳、精神狀態(tài)以及檢測輸血前后血常規(guī)，尿常規(guī)。

2 結果

2.1 體外配血試驗

紅細胞無凝集反應和溶血反應。

2.2 輸血前后貓臨床指標變化

輸血前正常。輸血中和輸血后貓精神沉郁，體溫升高，心跳呼吸加快，可視黏膜顏色正常。

2.3 輸血前后體溫變化

從圖1中可以看出輸血后貓的體溫變化不大，在第4天達到頂峰，隨后恢復正常。

圖1 貓輸血前后體溫變化Fig.1 The changes of temperature in cat before and after blood transfusion

2.4 輸血前后脈搏的變化

在圖2中輸血后心跳逐漸升高，在第4天達到峰值，然后逐漸降低，在第6天左右逐漸恢復到輸血前水平。

圖2 貓輸血前后心跳數(shù)變化Fig.2 The changes of number of heartbeats in cat before and after blood transfusion

2.5 輸血前后血常規(guī)變化

在圖3中貓紅細胞在輸血后會緩慢的增加。總體而言，紅細胞數(shù)目的變化不明顯。

圖3 貓輸血前后紅細胞數(shù)目變化Fig.3 The changes of number of erythrocytes in cat before and after blood transfusion

在圖4中貓白細胞數(shù)目在輸血后第1天開始上升，在第2天后開始降低。在第4天逐漸恢復。

在圖5中貓血紅蛋白數(shù)目在輸血后升高，然后逐漸回復到正常水平。

圖4 貓輸血前后白細胞數(shù)目含量變化Fig.4 The changes of number of white blood cells in cat before and after blood transfusion

圖5 貓輸血前后血紅蛋白含量變化Fig.5 The changes of hemoglobin content in cat before and after blood transfusion

2.6 輸血前后尿常規(guī)變化

從圖6～圖8中可以看出，膽紅素、蛋白質、尿膽原含量變化趨勢相似，在輸血后均明顯升高，在第5天到第6天后膽紅素、尿膽原含量基本恢復正常值，并趨于穩(wěn)定。其中尿蛋白在第2天達到最高后逐步下降，第5天恢復正常。

圖6 貓輸血前后膽紅素含量變化Fig.6 The changes of bilirubin content in cat before and after blood transfusion

圖7 貓輸血前后尿蛋白含量變化Fig.7 The changes of protein content in cat before and after blood transfusion

圖8 貓輸血前后尿膽原含量變化Fig.8 The changes of urobilinogen content in cat before and after blood transfusion

3 討論

血源的缺乏使得血液替代品一直是國際醫(yī)學和生物技術等領域的研究熱點，其中血液替代品也已經(jīng)發(fā)展到類似于天然紅細胞的結構和功能。脂質體包裹血紅蛋白制劑與紅細胞類的載氧血液替代品相比屬于細胞型血紅蛋白，表面不存在抗原，不會引起機體的排斥反應。因此，血紅蛋白脂質體可以作為一種新的輸血制劑用于貧血的治療［9－12］。Terajima K等［13］的研究表明，通過檢測血流動力學、血液平均動脈血壓、中心靜脈壓，心臟指數(shù)值在液體休克復蘇時脂質體包封血紅蛋白可以保護微循環(huán)免受損傷。本試驗中在豬血紅蛋白脂質體輸入受體貓體內(nèi)后一段時間內(nèi)，通過連續(xù)的監(jiān)測血常規(guī)和尿常規(guī)的方法，結果貓在整個試驗中沒有發(fā)生輸血反應，證明豬血紅蛋白脂質體對貓是安全可用，目前國內(nèi)外暫時還未見相關報道。

本研究中貓尿液中尿膽原以及膽紅素升高后再恢復正常，說明豬血紅蛋白在貓體內(nèi)存在大約2d～3d左右，相比而言無基質血紅蛋白的半衰期只有4 h左右［14］，其在機體內(nèi)存在時間較長。但在實驗中貓仍然表現(xiàn)出輕微的發(fā)熱反應，呼吸數(shù)增加，且白細胞的數(shù)目也會升高，對貓的免疫系統(tǒng)還是有一定的影響。因此，如何改進脂質體包裹血紅蛋白減少對機體的副作用以及延長半衰期，還需要進一步的研究。

豬血紅蛋白脂質體能迅速恢復動物機體血壓，具有有效擴充血容量并向組織供氧、復蘇瀕臨死亡動物的功能。由于豬血紅蛋白來源廣泛，經(jīng)過脂質體包裹后的豬血紅蛋白脂質體是異源輸血豐富的血液來源，這種安全、來源廣泛、價格低廉的動物血液替代品的載氧制劑在寵物市場上具有很大的應用前景。

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