姜燕霞，張淑玲，王金良，申識(shí)川

（1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256603；2.濱州市婦幼保健院，山東濱州256600；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；4.湖南省寧遠(yuǎn)縣畜牧水產(chǎn)局，湖南寧遠(yuǎn)425600）

犬細(xì)小病毒?。–anine parvovirus disease，CPVD）是由犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的犬的一種急性、烈性傳染病，該病于1978年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)，目前呈世界范圍內(nèi)流行，是危害犬類的最重要傳染病之一，每年都給全球養(yǎng)犬業(yè)和寵物行業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1－5］。CPV屬于細(xì)小病毒科（Parvoviridae）細(xì)小病毒屬（Parvovirus），基因組為單股線狀DNA病毒，全長(zhǎng)為5.0kb，編碼2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2），其中VP2蛋白是保護(hù)性顆?？乖?，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，VP2中的幾個(gè)關(guān)鍵堿基和氨基酸的變化就可改變病毒的抗原特性和宿主范圍［4－6］。近年來(lái)，CPV不斷出現(xiàn)新的變異情況，分離鑒定CPV的當(dāng)?shù)亓餍卸局暌约皩?duì)結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因進(jìn)行序列分析是了解和掌握CPV變異趨勢(shì)的主要方法［4.6－7］。本研究從疑似犬細(xì)小病毒感染犬糞便中成功分離鑒定一株CPV，并進(jìn)行了VP2基因序列分析，旨在豐富我國(guó)CPV分子流行病學(xué)資料，為CPV新型疫苗與診斷試劑的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2012年4月山東濟(jì)南某寵物醫(yī)院收診一例病犬，其臨床癥狀表現(xiàn)主要為嘔吐、體溫升高、精神沉郁、排血便。其血便經(jīng)犬細(xì)小病毒膠體金快速診斷試紙條檢測(cè)為陽(yáng)性。采集疑似犬細(xì)小病毒感染病犬的血便作為病料。

1.1.2 細(xì)胞與菌株 胎貓腎傳代細(xì)胞（FK81），大腸埃希菌菌株DH5α，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 ExTaq酶、dNTP、pMD18－T載體為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA多功能膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為北京百泰克生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理 將采集的臨床病料加入約5倍體積的滅菌生理鹽水，反復(fù)凍融3次，12 000r／min離心20min，吸取上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，即得待分離病毒樣品，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒分離 將待分離病毒樣品接種單層貓腎細(xì)胞（FK81），同時(shí)設(shè)不接種的正常細(xì)胞作為對(duì)照，置37℃培養(yǎng)24h后，將細(xì)胞生長(zhǎng)液棄去，換成細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)，每日早晚觀察細(xì)胞病變，待有約80%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變后，收獲病毒，再傳3代，置－70℃保存。

1.2.3 分離病毒血凝性的測(cè)定 取第4代病毒，按文獻(xiàn)血凝試驗(yàn)（HA）的操作方法測(cè)定其對(duì)于豬紅細(xì)胞的血凝性［8］。

1.2.4 分離病毒組織細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50）的測(cè)定 將分離的病毒株依次進(jìn)行10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度分別接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)FK81細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8孔，0.1mL／孔，同時(shí)設(shè)不接種的正常細(xì)胞作為對(duì)照，觀察至120h，記錄病變細(xì)胞數(shù)目，按 Reed－Muench法計(jì)算分離病毒的TCID50。

1.2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 選取CPV抗體陰性犬4只，2只經(jīng)皮下注射分離病毒1mL（含有104.5個(gè)TCID50），另2只犬注射滅菌生理鹽水作為對(duì)照，隔離飼養(yǎng)，觀察14d。每日觀察犬的食欲、精神、糞便等狀況，早晚各測(cè)量犬的體溫一次，采集犬的糞拭子進(jìn)行血凝測(cè)定。

1.2.6 VP2基因序列分析

1.2.6.1 引物設(shè)計(jì)與合成 利用 Oligo6.0生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增CPV VP2全長(zhǎng)基因的一對(duì)特異性引物，上 游 引 物 F：5′－ATGAGTGATGGAGCAGTTCAA－3′，下游引物 R：5′－TTAATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTG－3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.6.2 病毒基因組DNA的提取 按常規(guī)方法分別取凍融后的待分離病毒樣品、收獲的第4代病毒液的病毒基因組DNA。

1.2.6.3 VP2基因PCR擴(kuò)增 以提取的病毒基因組DNA為模板，按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。

1.2.6.4 VP2基因的克隆與序列分析 用DNA多功能膠回收試劑盒回收第4代病毒液VP2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將其與克隆載體pMD18－T于4℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。培養(yǎng)12h后，挑取單菌落，加LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，利用EcoRⅠ／SalⅠ雙酶切鑒定得到pMD－VP2陽(yáng)性重組質(zhì)粒，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNA Star生物學(xué)軟件與GenBank中8株CPV VP2基因序列進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離結(jié)果

將病料樣品接種單層FK81，5d后可見細(xì)胞特征性病變非常明顯，細(xì)胞逐漸圓縮，死亡細(xì)胞聚集在一起出現(xiàn)明顯的拉網(wǎng)現(xiàn)象，脫落（圖1A）。收獲病毒，繼續(xù)傳3代后，細(xì)胞特征性病變依然存在。收獲第4代病毒，將其命名為JN株，置－70℃冷凍保存。

圖1 FK81細(xì)胞病變情況Fig.1 The FK81cytopathogenesis

2.2 病毒血凝性測(cè)定結(jié)果

按常規(guī)血凝試驗(yàn)方法測(cè)定JN株第4代病毒對(duì)豬紅細(xì)胞的血凝效價(jià)為1∶512。

2.3 病毒TCID50的測(cè)定結(jié)果

按Reed－Muench法計(jì)算JN株病毒的TCID50為10－3.5／0.1mL。

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

2只犬在攻毒后4d開始表現(xiàn)食欲減退，精神沉郁，腹瀉、血便，同時(shí)體溫開始升高，犬的糞拭子開始具有血凝性。第10天和第11天2只攻毒犬先后死亡，剖檢病死犬可見全身脫水和消瘦，空腸和回腸局部充血，腸管內(nèi)壁彌漫性出血，肝臟出血，脾臟腫大。對(duì)照組2只犬沒有表現(xiàn)任何臨床癥狀。

2.5 VP2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳（圖2），在位于約1 755bp處可見特異性DNA擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小一致。

圖2 VP2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR products of VP2gene

2.6 VP2基因的序列鑒定結(jié)果

JN株第4代分離毒VP2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，連接到PMD18－T克隆載體上構(gòu)建pMDVP2重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ／SalⅠ雙酶切鑒定得到了約2 700bp片段（pMD18－T載體）和1 755bp片段（VP2基因）（圖3），將pMD－VP2重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的8株CPV VP2基因同一序列進(jìn)行核苷酸序列同源性比較分析發(fā)現(xiàn)（圖4和圖5），JN株屬于CPV－2a亞型，與其他8株CPV的核苷酸同源性在98.7%～99.6%之間。

圖3 重組質(zhì)粒pMD－VP2酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pMD－VP2by enzyme digestion

圖4 不同毒株的VP2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Different strains of VP2gene phylogenetic tree analysis

圖5 不同毒株的VP2基因序列核苷酸同源性Fig.5 The nucleotide homology of VP2gene sequences in different strains

3 討論

本研究從山東省濟(jì)南某寵物醫(yī)院臨床表現(xiàn)為嘔吐、高溫、精神沉郁、排血便的犬中分離得到一株CPV毒株，命名為JN株。該病毒對(duì)豬紅細(xì)胞的血凝效價(jià)為1∶512；Reed－Muench法測(cè)定該株病毒的TCID50為10－3.5／0.1mL；動(dòng)物回歸試驗(yàn)中經(jīng)皮下注射該病毒1mL的健康犬4d開始表現(xiàn)嘔吐、血便、發(fā)熱等典型的細(xì)小病毒癥狀，病死率達(dá)100%，表明該毒株為強(qiáng)毒株。將該病毒的VP2基因克隆后測(cè)序，結(jié)果顯示該病毒為CPV－2a亞型，VP2基因序列與GenBank中的8株CPV VP2基因序列核苷酸同源性在98.7%～99.6%之間。鑒于VP2蛋白在誘導(dǎo)抗病毒感染反應(yīng)中所起的免疫保護(hù)性作用，VP2基因成為細(xì)小病毒新型疫苗與診斷試劑研究的熱點(diǎn)，也是CPV分子流行病學(xué)調(diào)查的首選基因。CPV自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直在不斷變異，已引起很多學(xué)者的普遍關(guān)注。隨著我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)和寵物行業(yè)的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)犬?dāng)?shù)量不斷增加，CPV發(fā)病率也一直居高不下，嚴(yán)重阻礙我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展，急需加強(qiáng)CPV診斷與流行病學(xué)方面研究工作，了解不同地方CPV發(fā)病及流行情況，對(duì)預(yù)防和控制CPV具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義［8－12］。本研究成功分離了CPV JN株病毒并進(jìn)行了該毒株VP2基因的序列分析，豐富了國(guó)內(nèi)CPV分子流行病學(xué)資料，同時(shí)也為本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行CPV基因工程疫苗與新型診斷試劑的研究奠定了基礎(chǔ)。

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