謝志勤，謝芝勛，劉加波，龐耀珊，鄧顯文，謝麗基，范 晴，羅思思

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室，廣西南寧530001）

雞關節(jié)炎是由禽呼腸病毒（Avian reovirus，ARV）引起的危害商品雛雞的一種病毒病，隨著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，該病的發(fā)生也越來越來常見。由禽呼腸病毒引起的臨床癥狀主要為雛雞關節(jié)炎、腱鞘炎，嚴重時出現(xiàn)雞關節(jié)腫大，站立不穩(wěn)，從而導致吸收障礙，抵抗力下降，很容易繼發(fā)其他病原的感染而導致死亡，造成很大的經濟損失［1］。

禽呼腸病毒是雙股RNA病毒，屬于呼腸病毒科、呼腸病毒屬，其基因組由大（L）、中（M）和?。⊿）三組基因組成，分為10個節(jié)段，σNS基因屬于S基因組中S4基因，其編碼的蛋白是一種較小的非結構蛋白，具有單股RNA（ssRNA）結合活性，目前已知的σNS蛋白功能與病毒中mRNA有關，并且與基因組的復制有關［2－4］。

目前，對禽呼腸病毒的檢測已建立了很多方法，主要有病毒中和試驗、瓊脂擴散試驗、ELISA［5］、RT－PCR［6］和熒光定量 RT－PCR［7－9］等，基于單克隆抗體（mAb）建立的免疫檢測技術，具有特異性強和敏感度高的優(yōu)點，在疾病診斷方面已得到了廣泛的應用。目前，未見有針對ARVσNS的單克隆抗體，本研究利用σNS蛋白篩選出抗ARVσNS蛋白的特異性單克隆抗體，并對其生物學特性進行鑒定，為建立一種敏感、特異、快速、簡便的ARV臨床檢測方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 ARV S1733毒株，由美國康州大學Khan博士惠贈；骨髓瘤細胞SP2／0由美國賓夕法尼亞州州立大學動物診斷中心劉教授惠贈；ARV R1、ARV R 2以及雞新城疫病毒（LaSota，NDV）、H9亞型禽流感病毒（AIV H9）、雞傳染性支氣管炎病毒M41（IBV M41）、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）由廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室保存。

1.1.2 雞胚和實驗動物 SPF種蛋購自北京梅里亞公司，經本實驗室于37℃嚴格無菌孵化，供病毒增殖用；Balb／c小鼠，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.3 主要酶與劑試 預染低分子質量蛋白MarkerⅢ，購自天根生物公司；弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑，胎牛血清，1640改良培養(yǎng)基，細胞融合劑（PEG－4000），HRP／FITC 標 記的 羊 抗 鼠IgG，BCIP／NBT，HAT，HT選擇培養(yǎng)基，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，TEMED，Tris堿和過硫酸銨，均購自Sigma公司；其他試劑為分析純國產試劑。

1.2 方法

1.2.1 抗原的增殖 將ARV S1733毒株用滅菌的PBS溶液進行100倍稀釋后，卵黃囊腔接種8日齡的SPF雞胚0.2mL，37℃培養(yǎng)，棄去24h內的死胚，收獲24h～96h內死胚的尿囊液和尿囊膜。尿囊膜用滅菌研缽進行研磨，然后與尿囊液混合，在－70℃凍融3次，直接用于病毒的純化或置－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗原的濃縮與純化 將收獲的病毒液以8 000r／min離心15min，收集上清液用病毒濃縮儀和濃縮過濾器（Master Flex console driver，7520－47，美國Thermo Fisher Scientific產品）進行1／5濃縮；經濃縮的病毒液用250g／L～700g／L的蔗糖進行密度梯度離心純化，40 000r／min離心4h，收集病毒，用PBST溶液洗滌，20 000r／min離心2h，收集沉淀即為純化的病毒，用SDS－PAGE分析并用碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所，產品編號：P0012）測定病毒濃度。

1.2.3 免疫Balb／c小鼠 取健康6周齡Balb／c小鼠3只，將純化的病毒測定濃度后，按首免注射100 μg的劑量與等體積弗氏完全佐劑乳化，二免、三免各注射100μg的劑量與等體積弗氏不完全佐劑乳化，腹腔注射免疫Balb／c小鼠，四、五次免疫不用佐劑，各免注射100μg的劑量。首次與二次免疫間隔20d，三、四、五次免疫間隔3d～7d不等，五次免疫3d后尾靜脈采血，測定靜脈血中的抗體效價，選效價高的小鼠進行細胞融合試驗。

1.2.4 間接ELISA篩選方法的建立 將純化的ARV按一定的濃度包被ELISA板，包被液為4℃保存的0.05mol／L 碳酸緩沖液（pH9.6），然后用小鼠制作的ARV陽性血清進行系列稀釋后作為一抗，濃度從1∶100倍比稀釋到1∶6 400，加到ARV包被的ELISA板進行方陣試驗，以確定最佳的抗原包被濃度以及抗體稀釋度濃度，確定陰陽性臨界值，以陽性血清和抗原的OD值最接近于1.0時的最大稀釋濃度作為抗原抗體的最適工作濃度，建立間接ELISA檢測方法。

1.2.5 融合細胞的篩選和單克隆抗體的制備 細胞融合、腹水制備、單克隆抗體的純化按常規(guī)方法［10］進行。利用已建立好的間接ELISA方法進行篩選。

1.2.6 單克隆抗體效價的測定及鑒定 利用已建立的間接ELISA方法檢測小鼠腹水效價；對雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體（細胞上清液）用Southern－Biotech公司出產的SBA ClonotypingTM System／HRP單克隆抗體分型試劑盒進行鑒定，操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.7 單克隆抗體特異性鑒定

1.2.7.1 Western blot檢測 采用變性還原SDSPAGE，濃縮膠配制為60g／L，分離膠配制為120 g／L，σNS蛋白上樣量每孔為20μL含30mg／mL，與上樣溴酚藍混合，沸水中煮5min，60V電壓至分離膠與濃縮膠交匯處，然后改用120V電壓至溴酚藍到達底部。用Invitrogen公司生產的電轉移儀iBlot（型號：10048044）及轉移試劑盒 （iBlot Gel Transfer Stacks PVDF，Regular，型號：IB4010－01）將病毒蛋白轉移到硝酸纖維膜上，用50g／L的脫脂奶固定1h，用PBST溶液洗膜3次，用制備的單抗腹水按1∶200稀釋后加到硝酸纖維膜上，37℃作用1h后，用PBST溶液洗膜3次，加入磷酸酶標志的羊抗鼠二抗，37℃作用1h后，用PBST溶液洗膜3次，加入BCIP／NBT進行顯色10min。

1.2.7.2 Dot－ELISA 檢測 將純化的σNS蛋白、ARV S1733、ARV R1和ARV R2以及NDV、AIV、IBV、ILTV、IBDV各10μL分別點在NC膜上，在超凈工作臺干燥后加入50g／L的脫脂奶粉于37℃封閉1h，PBS洗滌后分別加入經稀釋的單克隆抗體及SP2／0骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清，37℃作用1h后，加入磷酸酶標記的羊抗鼠IgG抗體，37℃作用1h后，用PBS液洗滌3次，每次5min，然后加入顯色液進行顯色，觀察結果。

1.2.7.3 直接免疫熒光（DFA）法檢測 用9日齡的SPF雞胚制備雞胚成纖維細胞，細胞在24孔板中長成單層后，用ARV S1733毒株感染雞胚成纖維細胞，37℃培養(yǎng)30h后，在顯微鏡下觀察有細胞病變出現(xiàn)，用丙酮和乙醇進行固定30min，比例為3∶2，吸出固定液，然后分別加入用FITC標記的σNS蛋白單克隆抗體及SP2／0骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清，37℃作用1h，用PBS溶液洗滌3次后，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.2.7.4 病毒中和試驗 參照文獻［11］的方法測定ARV的EID50，采用固定病毒的方法，將單克隆抗體倍比稀釋后與相同體積的200EID50／0.2mL的ARV S1733毒株充分混勻，同時設ARV S1733陽性和陰性對照，37℃作用1h，然后接種于生長良好的96孔細胞板單層的成纖維細胞中，于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48h。用直接免疫熒光（FA）的方法進行病毒中和檢測，記錄細胞的病變和熒光情況。

2 結果

2.1 抗原的濃縮與純化

利用病毒濃縮儀和濃縮過濾器收集的病毒，再經過蔗糖密度梯度離心獲得的純化病毒，經測定濃度為40.5mg／mL。

2.2 間接ELISA篩選方法的建立

將純化的ARV測定其濃度后包被酶標板，加入一抗和二抗后經方陣試驗，確定最佳的σNS蛋白抗原工作濃度為25μg／mL，抗體稀釋度濃度為1∶800，封閉液為10g／L的BSA，37℃孵育1h；酶標二抗稀釋度為1∶1 000，37℃孵育1h；洗液為含0.5mL／L吐溫－20的PBS。

2.3 雜交瘤細胞分泌抗體的測定

應用建立的σNS蛋白ELISA檢測方法對雜交瘤細胞分泌的抗體進行測定，初步判為陽性的有3孔，再次篩選陽性為1個孔，然后進行3次亞克隆，最后獲得1株能穩(wěn)定分泌抗ARVσNS蛋白抗體的陽性雜交瘤細胞株，命名為SB2－1K3。擴大培養(yǎng)獲得的細胞株，離心收集細胞后注入Balb／c小鼠腹腔并制備出腹水，經測定效價為1∶10 000以上。

2.4 單克隆抗體亞類的鑒定

用SBA ClonotypingTM System／HRP單抗分型系統(tǒng)對制備的1株分泌單克隆抗體進行鑒定，鑒定結果為IgG 1亞類單克隆抗體，其輕鏈均為κ鏈（表1）。

表1 細胞上清反應性與單克隆抗體亞類的鑒定結果Table 1 The results of reactivity of hybridoma supernatant and isotype of monoclonal antibodies

2.5 Western blot檢測

純化的σNS蛋白經SDS－PAGE變性電泳，考馬斯亮藍染色后出現(xiàn)了2條分別約為66ku和27 ku的蛋白帶，經Western blot后，ReoS1733和分離株R1只出現(xiàn)約為66ku的蛋白帶（圖1）。

圖1 單抗Western blot檢測結果Fig.1 The detection results of monoclonal antibody by Western blot

2.6 Dot－ELISA檢測

將σNS蛋白、ARV S1733、ARV R1和ARV R 2以及對照的病毒液各10μL分別點在NC膜上進行Dot－ELISA試驗，以陽性鼠血清作為陽性對照，SP2／0骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照。2株MAb SF6－3K3和SB2－1K3只與未經變性處理的ARV毒株發(fā)生特異性反應，出現(xiàn)棕色的反應斑，與NDV、AIV、IBV、ILTV、IBDV 等對照株均無交叉反應，骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清也沒有出現(xiàn)反應斑，證明1株單克隆抗體有良好的特異性（圖2和表2）。

圖2 Dot－ELISA檢測單克隆SB2－1的特異性結果Fig.2 The specific test results of monoclonal antibody SB2－1by dot－ELISA

表2 單克隆抗體SB2－1K3的Dot－ELISA特異性鑒定結果Table 2 Specificity identification of monoclonal antibody SB2－1K3by Dot－ELISA

2.7 直接免疫熒光（DFA）法檢測

將ARV S1733感染雞胚成纖維細胞后，用丙酮和乙醇進行固定，然后用FITC標記的單克隆抗體進行染色，洗滌后在熒光顯微鏡下，結果ARV S1733感染的雞胚成纖維細胞出現(xiàn)熒光，而用SP2／0骨髓瘤培養(yǎng)上清以及沒有感染的細胞沒有出現(xiàn)熒光（圖3）。

圖3 直接免疫熒光法檢測 MAbs SB2－1與感染禽呼腸病毒S1733的反應結果Fig.3 Direct immunofluorescence detection of fibro cells infected with Reo S1733strain by MAbs SB2－1

2.8 病毒中和試驗

將單克隆抗體倍比稀釋后與相同體積的200 EID50／0.2mL的ARV S1733毒株充分混勻感染雞胚成纖維細，結果所有稀釋的單抗組與病毒對照一樣均出現(xiàn)細胞病變，而陰性對照則沒有細胞病變；用直接免疫熒光（FA）方法進行染色檢測，在熒光顯微鏡下，試驗組與陽性病毒組一樣出現(xiàn)熒光，陰性對照沒有熒光出現(xiàn)。

3 討論

在畜禽傳染病方面，已有很多單克隆抗體的制備和鑒定［12－13］。正是由于單克隆抗體具有特異性高、敏感性強的特點，已被廣泛應用于各類傳染病病原的血清學檢測和診斷中。本研究是根據(jù)禽呼腸病毒在檢測方面的需要，有針對性地進行單克隆抗體的制備和特性鑒定，從而為進一步建立快速診斷技術奠定基礎。

進行單克隆抗體的制備，病毒的純化非常關鍵，各種病毒的純化根據(jù)需要有各自不同的方法，本研究所用的病毒是雞胚增殖的病毒，其病毒含量不夠純，在病毒純化是首先采用低速離心，去掉一部分的雜物，然后采用病毒濃縮儀和過濾器進行濃縮，將大部分的水分去掉，再通過蔗糖密度梯度離心，獲得的純化病毒，其純度較高，在用于免疫和包被抗原時，可以盡可能排除非特異反應。另外，通過這樣純化而獲得的病毒，其病毒結構的構象沒有發(fā)生變化，排除了因直接超速離心濃縮而帶來的病毒結構構象的改變，從而在免疫時因構象改變而產生的其它分泌抗體的產生。

本試驗采用FITC直接標記的單克隆抗體進行染色，在細胞培養(yǎng)時，適當降低培養(yǎng)液中血清的濃度，在接毒時延長病毒與細胞的吸附時間和洗滌時間，這樣盡可能地排除了假陽性結果的出現(xiàn)，提高了鑒定效率。

本試驗中，應用Dot－ELISA方法對制備的單克隆抗體與對照的 NDV、AIV、IBV、ILTV、IBDV 進行特異性檢測，均無交叉反應，證明制備的單克隆抗體有良好的特異性?？梢詰帽驹囼炛苽涞膯慰寺】贵w，建立用于特異性檢測禽呼腸病毒的試劑盒，為鑒別診斷禽呼腸病毒奠定了基礎。

本試驗通過病毒中和試驗，證明本研究制備的單克隆抗體不具有中和禽呼腸病毒的能力，由此可以推斷其識別的線性表位不是中和表位，只能識別禽呼腸病毒抗原的表位。本試驗得到的mAb雖然不具有中和病毒的活性，但具有特異識別禽呼腸病毒的功能，因此，在建立準確診斷由禽呼腸病毒引起的疫病方面將會發(fā)揮重要的作用。

［1］ 卡爾尼克B W.禽病學［M］.10版.高 福，等，譯.北京：中國農業(yè)大學出版社，1999：902－908.

［2］ 謝芝勛，秦 宇，謝麗基，等.應用禽呼腸病毒σ3融合為抗原的ELISA 檢測方法的建立［J］.畜牧與獸醫(yī)，2007，39（11）：3－7.

［3］ Benavente J，Martinez－Costas J.Avian reovirus：Structure and biology［J］.Virus Res，2007，123（2）：105－119.

［4］ Yin H S，Lee L H.Identification and characterization of RNA－binding activities of avian reovirus non－structural protein sigmaNS［J］.J Gene Virol，1998，79：1411－1413.

［5］ 秦春香，謝芝勛，謝麗基，等.利用σ3和σ2重組蛋白檢測禽呼腸病毒抗體ELISA 的建立［J］.西南農業(yè)學報，2009，22（2）：492－496.

［6］ 廖 敏，謝芝勛，謝志勤，等.一步法RT－PCR檢測禽呼腸病毒的研究［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2003，25（1）：53－55.

［7］ 童桂香，謝芝勛，黃 琦，等.禽呼腸孤病毒實時熒光定量RTPCR檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)科學，2007，37（9）：767－771.

［8］ 羅 嬋，王志強，公方強，等.SYBR Green實時熒光定量PCR檢測水牛體細胞組蛋白乙?；嚓P基因mRNA表達［J］.中國獸醫(yī)學報，2009，29（2）：233－237.

［9］ 熊文婕，謝芝勛，唐 熠，等.SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT－PCR檢測禽呼腸孤病毒δC和δNS基因方法的建立［J］.廣西農業(yè)科學，2010，41（4）：366－370.

［10］ Jari L，Pauliina N，Janita L，et al.Characterization of monoclonal antibodies against prostate specific antigen produced by genetic immunization［J］.J Immunol Meth，2004，289（1）：157－167.

［11］ 廖 敏，謝芝勛，劉加波，等.雞呼腸孤病毒分離與鑒定［J］.中國家禽，2002，24（1）：12－14.

［12］ 杜秋明，魯 承，高建偉，等.鵝細小病毒單克隆抗體的制備與鑒定［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（2）：162－164.

［13］ 李曉軍，張婷婷，孟凡依，等.抗Ⅰ型鴨肝炎病毒單克隆抗體的制備及其生物學特性鑒定［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2011，33（6）：487－489.