魏妮娜，王曉明，牛憲立，姬可平

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物化學(xué)與細胞分子生物學(xué)教研室，廣東珠海 519041)

紅芪(Radix Hedysari)為豆科植物多序巖黃芪(Hedysarum polybotrys)的干燥根，為甘肅省道地中藥材，在甘肅省分布較廣，其中岷縣最為出名［1］。中藥材傳統(tǒng)鑒定技術(shù)多采用新鮮植株材料，鑒定人員需具備一定的植物分類學(xué)知識和經(jīng)驗，市面上銷售的紅芪多為加工過的藥材，其表面性狀及顯微特征均已發(fā)生變化，給鑒定工作帶來很大的困難［3］。本文采用ITS序列對中藥材紅芪從分子水平進行鑒定，旨在探討ITS條形碼技術(shù)對中藥材鑒定的有效性。

1 材料

1.1 供試材料 供試材料紅芪由通訊作者購買于甘肅省定西地區(qū)岷縣藥材公司，并經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定，憑證標(biāo)本存放于遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物化學(xué)與細胞分子生物學(xué)教研室。

1.2 試驗試劑 三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、醋酸鈉、硼酸，購于天津大茂化學(xué)試劑廠;Tris－飽和酚、氯仿、異戊醇、濃HCl、異丙醇、無水乙醇，購于廣州番禺力強化工廠;瓊脂糖、GoldView TM購于莊萌生物;高保真即用型PCR試劑盒、RNase，購于上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;ITS序列擴增引物合成于北京六合華大基因科技股份有限公司。

1.3 試驗儀器 液氮罐(東亞液氮罐YDS系列)、高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)、恒溫水浴箱(北京長源實驗設(shè)備廠)、高速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、DYCP－31DN型瓊脂糖水平電泳儀(北京六一儀器廠)、EDC－810型基因擴增儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)、WD－9413B型凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 總DNA的提取 采用改良的CTAB法提取靶植物的總 DNA［4］。

2.2 PCR擴增 采用ITS序列的通用引物P1:5’－ATGTCACCACAAACAGAAAC －3’，P2:5’－TCGCATGTACCTGCAGTAGC－3’。采用引物 P1和引物P2對供試品的ITS序列進行擴增。在25(l反應(yīng)體系中，含模板 DNA1(l、引物各 1.0(l、ddH2O10(l、2 × PCR Master13(l。擴增:92 ℃ 預(yù)變性5 min;92℃變性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán);72℃延伸5 min。

2.3 測序 用1.0%瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物初步鑒定后，將符合測序要求的樣品送往北京六合華大基因科技股份有限公司(廣州分公司)進行雙向測序;應(yīng)用CodonCode Aligner軟件將測序峰圖剪切拼接，獲得高質(zhì)量ITS序列。

2.4 登錄GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫 將ITS序列進行BLAST相似性搜索，確定是否是該物種的同屬或者同科植物，并將所得序列提交到GeneBank，獲得登錄號。

2.5 序列對比分析 將樣品的ITS序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中已有的紅芪、黃芪 ITS序列應(yīng)用MEGE5.1進行序列對比，計算遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹。

3 結(jié)果

3.1 測序結(jié)果及序列分析 將雙向測序所得序列峰圖應(yīng)用CodonCode Aligner軟件將測序峰圖剪切拼接，獲得高質(zhì)量ITS序列(見圖1)。

圖1 紅芪ITS堿基序列

將紅芪ITS序列提交到NCBI利用BLAST進行相似性搜索，查看前十個搜索結(jié)果(見表1)。將紅芪ITS序列提交給 NCBI，獲得登錄號KF032294。

3.2 堿基變異位點分析 將中藥材紅芪的ITS序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫里已有的多序巖黃芪(Hedysarum polybotrys)、太白巖黃芪(Hedysarum vicioides)、錫金巖黃芪(Hedysarum sikkimense)、黃芪(Astragalusmembranaceus)ITS序列應(yīng)用MEGE5.1進行序列對比，分析結(jié)果(見圖2)。

表1 Blast相似度搜索結(jié)果

從圖3中可看出，中藥材紅芪與多序巖黃芪、太白巖黃芪的ITS序列之間有5個變異位點，分別為129位點的A－G變異，157位點G缺失，264位點的A－C、559位點的T－C和676位點T插入。中藥材紅芪與錫金巖黃芪的ITS序列之間有12個變異位點，而中藥材紅芪與黃芪的ITS序列之間有102個變異位點。

3.3 遺傳距離分析 將中藥材紅芪、多序巖黃芪、太白巖黃芪、錫金巖黃芪、黃芪的ITS序列進行分析，根據(jù)堿基變異位點的情況，應(yīng)用MEGA5.1軟件計算出物種間的遺傳距離(見表2)。

圖2 ITS序列的變異位點

表2 兩兩樣品之間的遺傳距離

由表3可得出，紅芪、多序巖黃芪與太白巖黃芪這三個物種的K－2P距離在0.000到0.004之間，紅芪與錫金巖黃芪的K－2P距離為0.018，而紅芪與黃芪的K－2P距離為0.153。

3.4 系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹分析 從基于ITS條形碼序列構(gòu)建的紅芪與其近緣物種的NJ樹(見圖3)可以看出，紅芪、多序巖黃芪與太白巖黃芪聚為一支，后又與同屬植物錫金巖黃芪聚為一支。而黃芪獨立為一支。從NJ樹圖可以看出紅芪與黃芪能明顯區(qū)分開。

圖3 紅芪與近緣物種ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

據(jù)調(diào)查市面上出售的紅芪價格高于黃芪，兩者的價格差異主要是因采挖的方式不同，紅芪生長在灌木叢中，黃芪是人工規(guī)?；N植，但加工后紅芪和黃芪的形狀是相同的。紅芪作為黃芪的近緣植物，在我國西北、西南、港澳臺及東南亞地區(qū)仍有將紅芪和黃芪互為替代品的使用習(xí)慣，在港澳及東南亞等地更有認(rèn)為紅芪的藥用價值大于黃芪。

近年來植物DNA條形碼的研究異?；馃?，焦點集中在對植物DNA條形碼候選片段的分析篩選實驗和整體評價。然而這項技術(shù)尚在研究階段，迄今為止，在陸生植物中還沒有找到理想并具通用性的 DNA 條形碼［5－10］。

本實驗提取經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定的中藥材紅芪總DNA，擴增ITS序列進行雙向測序，以保證ITS序列的完整性;紅芪的ITS序列總長為680bp，CG含量占54.6%。其中ITS1長299bp，CG含量占57.9%;5.8S 長 161bp，CG 含量占 50.4%;ITS2 長220bp，CG含量占58.6%。將紅芪ITS序列提交到NCBI利用BLAST進行相似性搜索。查看前十個搜索結(jié)果(見表1)，結(jié)果顯示與所檢測序列所屬的植物屬于同屬或同科植物，證明測序準(zhǔn)確。中藥材紅芪ITS序列與其NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中已有的多序巖黃芪和同屬植物太白巖黃芪的ITS序列幾乎完全一致，而與近緣物種黃芪變異較大，故ITS序列可有效區(qū)分紅芪與其近緣物種黃芪。因此，ITS條形碼技術(shù)對加工后的中藥材鑒定有效性提供了依據(jù)。

［1］楊林，譚玉玲.中藥紅芪研究現(xiàn)狀［J］.中外醫(yī)療，2010，15(5):120－121.

［2］劉麗華，李加林.黃芪與紅芪的高效液相色譜鑒定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(5):1277 －1278.

［3］袁毅君，王廷璞，李蕊，等.甘肅道地藥材紅芪的質(zhì)量控制研究進展［J］.天水師范學(xué)院學(xué)報，2010，30(5):43－46.

［4］王曉明，姬可平，牛憲立，等.matK序列作為DNA條形碼在中藥雞骨草中的應(yīng)用［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39(2):132－134.

［5］李丹丹，郭水良，于晶，等.基于4個葉綠體基因識別蓑蘚屬(Macromitrium)植物的可行性研究［J］.植物科學(xué)學(xué)報，2013，31(1):23 －33.

［6］王曉明，姬可平，牛憲立，等.DNA條形碼與動植物分類學(xué)的研究［J］.生物信息學(xué)，2012，10(2):1672 －5565.

［7］Hou Dianyun，Song Jingyuan.Molecular identification of Corni Fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences［J］.Chinese Journal of Natural Medicines，2013，11(2):0121－0127.

［8］陳士林，姚輝，韓建萍，等，中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則［J］.中國中藥雜志，2013，38(2):141－148.

［9］高連明，劉杰，蔡杰，等.關(guān)于植物DNA條形碼研究技術(shù)規(guī)范［J］.植物分類與資源學(xué)報，2012，34(6):592－606.

［10］袁慶軍，張文婧，姜丹，等.論中藥分子鑒定的方法和原則［J］.植物分類與資源學(xué)報，2012，34(6):607－613.