黃昕艷， 趙錦程， 尉榮翠， 楊 智， 劉 爽， 朱曉峰

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)退變性病變，其典型的臨床病理學(xué)改變?yōu)棣碌矸蹣拥鞍?β-amyloid protein，Aβ)沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)元缺失［1］。Aβ是老年斑的核心成分，在AD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)Aβ25-35寡聚體誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷來(lái)探討其活性及形態(tài)學(xué)指標(biāo)的變化，篩選Aβ25-35寡聚體致傷條件下適宜的AD細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物:新生 Wistar大鼠(1～3d)，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。(2)主要試劑:DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、B27、Neurobasal-A培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(購(gòu)于美國(guó)Gibco公司);Aβ25-35、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、HFIP(六氟丙醇)購(gòu)于武漢博士德公司;兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)單克隆抗體、SABC即用型試劑盒、DAB顯色試劑盒(購(gòu)于Boster公司);青霉素、鏈霉素(華北制藥股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 出生1～3d內(nèi)的Wistar大鼠，無(wú)菌條件下斷頭，在冰浴的D-hank s液中取腦并分離出雙側(cè)海馬組織，剪切成約1mm×1mm×1mm的組織塊，0.125%胰酶37℃消化約20min。用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中終止消化，用口徑光滑的小吸管反復(fù)吹打分散，200目細(xì)胞篩過(guò)濾后，1000r/min，離心5min，棄掉上清液，加入培養(yǎng)基重懸，制成(2～3)×105個(gè)/ml密度的細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先用0.1mg/ml多聚賴氨酸包被的96、24、6孔板中。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后換成Neurobasl+B27(2%)培養(yǎng)基，以后每3d換液1次。

1.2.2 神經(jīng)元鑒定 培養(yǎng)至7d的神經(jīng)細(xì)胞，以PBS輕洗3遍，4%多聚甲醛固定30min后，PBS洗2次。0.4%TritonX-100破膜 20min，PBS洗 3遍，山羊血清封閉30min，滴加NSE(1∶200稀釋)一抗，4℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。次日PBS洗3遍，加二抗室溫避光孵育50min，PBS洗3遍;加新鮮配制的DAB溶液顯色，待顯色充分后，加入三蒸水終止反應(yīng)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡觀察，(PBS代替一抗做陰性對(duì)照)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將原代培養(yǎng)8d后的神經(jīng)元隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組、損傷組，加入終濃度分別為 1.0、5.0、10.0、20.0μmol/L 的 Aβ25-35寡聚體，Aβ25-35寡聚體的制備參考王建秀等文獻(xiàn)［2］，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.2.4 神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和定量分析Aβ25-35寡聚體孵育24h后，于倒置顯微鏡下觀察其存活情況和形態(tài)，隨機(jī)選取30個(gè)視野，記錄每個(gè)視野內(nèi)有突起的細(xì)胞數(shù)和突起總數(shù)，同時(shí)目鏡微尺測(cè)量突起的長(zhǎng)度，重復(fù)3次。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 采用MTT比色法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的存活率。按上述分組處理24h后，向96孔板中各組細(xì)胞分別加入 5mg/ml MTT20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞570nm吸光度值(opti-cal density，OD)。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，計(jì)算其平均值，同時(shí)設(shè)不加細(xì)胞的空白孔。根據(jù)公式計(jì)算:細(xì)胞存活率(%)=處理組細(xì)胞OD值/對(duì)照組細(xì)胞OD值×100%。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 接種后的海馬神經(jīng)細(xì)胞呈圓形，單個(gè)均勻分布，2h后開(kāi)始貼壁，培養(yǎng)24h后細(xì)胞大部貼壁且部分已長(zhǎng)出突起。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，突起逐漸增多、延長(zhǎng)并交織成網(wǎng)。胞體呈多角形或橢圓形，周圍有光暈，胞體體積較大，透光性強(qiáng)，核大;培養(yǎng)至7d的細(xì)胞胞體飽滿、有立體感;突起明顯增多、增長(zhǎng)、交織成網(wǎng)、細(xì)胞生長(zhǎng)成熟。與陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照比較，NSE免疫染色顯示95%以上的培養(yǎng)細(xì)胞為陽(yáng)性染色，符合細(xì)胞原代培養(yǎng)純度要求(見(jiàn)圖1)。

圖1 神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)(×100)

Aβ致傷模型組可見(jiàn)到部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)胞體縮小，細(xì)胞周圍暈光不強(qiáng);細(xì)胞突起消失或明顯減少、縮短，細(xì)胞碎片增多，甚至細(xì)胞崩解，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目下降等變化。Aβ1.0μmol/L組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常，貼壁良好、突起較長(zhǎng)，可相互連接成網(wǎng)絡(luò)。Aβ5.0μmol/L組神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不如正常對(duì)照組旺盛，神經(jīng)元突起數(shù)目、長(zhǎng)度與正常對(duì)照組相比有明顯的差異(P ＜0.05，P ＜0.01)。Aβ10.0μmol/L組神經(jīng)細(xì)胞存活狀態(tài)欠佳，突起變短，有較多的圓形及浮細(xì)胞，其突起的細(xì)胞數(shù)、神經(jīng)元突起數(shù)目、長(zhǎng)度與正常對(duì)照組相比有顯著的差異(P＜0.05，P＜0.01，P ＜ 0.01)。Aβ20.0μmol/L 組神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)較差，多數(shù)細(xì)胞突起變短、消失，細(xì)胞碎片較多。其突起的細(xì)胞數(shù)、神經(jīng)元突起數(shù)目、長(zhǎng)度與正常對(duì)照組相比有顯著的差異(P ＜0.01，P ＜0.01，P ＜0.01)，見(jiàn)圖2、表1。

2.2 Aβ25-35寡聚體誘導(dǎo)損傷后神經(jīng)細(xì)胞存活的影響 MTT測(cè)定結(jié)果顯示，Aβ25-35寡聚體可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞抑制，且神經(jīng)細(xì)胞抑制表現(xiàn)為與Aβ寡聚體濃度依賴性關(guān)系，即隨著Aβ寡聚體濃度增加神經(jīng)細(xì)胞，存活率逐漸下降，其中20μmol/L組最明顯，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Aβ25-35寡聚體毒性會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷(見(jiàn)圖2)。

圖2 Aβ不同致傷濃度對(duì)原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的影響(倒置顯微鏡，×100)

表1 Aβ25-35對(duì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的影響(χ ± s，n=30)

表2 不同濃度Aβ肽對(duì)海馬神經(jīng)元的影響(±s)

表2 不同濃度Aβ肽對(duì)海馬神經(jīng)元的影響(±s)

與空白對(duì)照組比較*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別Aβ肽濃度(μmol/L)MTT吸光度(n=6)存活率(%)正常組模型組 1.0 5.0 10.0 20.0 1.23 ±0.05 1.19 ±0.04 0.96 ±0.06 0.87 ±0.05*0.62 ±0.03＊＊98.24 ±2.17 89.86 ±3.23 75.95 ±2.05 58.86 ±3.11

3 討論

Aβ級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)的提出源自對(duì)AD的神經(jīng)病理特征的發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)確認(rèn)老年斑的主要構(gòu)成物質(zhì)是β淀粉樣物質(zhì)，Aβ在腦內(nèi)異常聚集引起神經(jīng)毒性，包括直接毒性和增強(qiáng)、放大各種傷害性毒性，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡［3］。

目前認(rèn)為，Aβ在大腦皮質(zhì)內(nèi)的蓄積是AD病理發(fā)生過(guò)程中的一個(gè)早期必然事件［4］，研究表明，Aβ在形成纖維性沉積前的中間體狀態(tài)，即Aβ寡聚體亦可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，Aβ寡聚體可以在生理水平明顯抑制大鼠海馬的突觸傳遞［5］。且發(fā)現(xiàn)在AD發(fā)病早期還未出現(xiàn)明顯的老年斑之前，其認(rèn)知功能的減退與可溶性Aβ水平及突觸功能障礙密切相關(guān)［6，7］。因此，建立良好而穩(wěn)定的AD突觸損傷模型對(duì)探索AD早期記憶損害事件的成因及AD發(fā)病機(jī)制的研究非常重要。

Aβ肽全長(zhǎng)的第25～35個(gè)氨基酸殘基是Aβ的非生理性最小毒性片段，故本實(shí)驗(yàn)以Aβ25-35寡聚體致傷與記憶密切相關(guān)的海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，來(lái)篩選適宜的AD突觸損傷模型，為AD早期的防治探求的有效的途徑。

Aβ25-35寡聚體致傷 24h后從形態(tài)學(xué)觀察，Aβ25-35寡聚體可致神經(jīng)細(xì)胞損傷，且神經(jīng)細(xì)胞毒性表現(xiàn)與 Aβ25-35寡聚體呈劑量依賴性關(guān)系，其中Aβ25-3520μmol/L組致傷顯著，細(xì)胞存活狀態(tài)差，有部分細(xì)胞脫壁，細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)消失，細(xì)胞外基質(zhì)雜亂，其突起的細(xì)胞數(shù)、神經(jīng)元突起數(shù)目、長(zhǎng)度與正常對(duì)照組相比有顯著的差異(P＜0.01);不適宜作為AD突觸損傷模型進(jìn)行下一步研究。

Aβ25-3510μmol/L組突起的細(xì)胞數(shù)、神經(jīng)元突起數(shù)目與Aβ25-3520μmol/L組相比有所改善，突起的細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組相比有一定差異(P＜0.05)，但神經(jīng)元突起數(shù)及突起的長(zhǎng)度與正常對(duì)照組相比仍有顯著的差異(P＜0.01)，大部分神經(jīng)細(xì)胞突起已喪失，故也不宜作為適宜的突觸損傷模型。

Aβ25-355μmol/L組細(xì)胞生存狀態(tài)尚可，突起的細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組比照差異不顯著，神經(jīng)元突起數(shù)目與正常對(duì)照組相比(P＜0.05)，突起的長(zhǎng)度與正常對(duì)照組相比有顯著的差異(P＜0.01)，損傷模型中神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量尚穩(wěn)定，神經(jīng)元突起數(shù)目有部分損失，但尚可作為Aβ致突觸損傷模型做進(jìn)一步研究。

對(duì)于Aβ25-351μmol/L組細(xì)胞損傷效果不明顯，神經(jīng)元突起數(shù)、突起長(zhǎng)度與正常對(duì)照組比較差異不顯著，不宜作為有效的突觸損傷模型。

在MTT測(cè)定結(jié)果顯示 Aβ25-3510μmol/L組與Aβ25-3520μmol/L組細(xì)胞存活率降低較明顯，不適宜作為AD的突觸損傷模型，同樣支持上述結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)以Aβ25-35寡聚體致傷海馬神經(jīng)細(xì)胞，篩選出5μmol/L為適宜的AD突觸損傷模型的致傷濃度，希望為AD早期的防治探索更有效的途徑。

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