趙瑞杰， 孫 莉， 劉星苗， 梁 浩， 趙麗輝， 程 焱

羥基紅花黃色素A抑制腦組織蛋白質(zhì)硝基化的體外研究

趙瑞杰1， 孫 莉2， 劉星苗2， 梁 浩2， 趙麗輝1， 程 焱2

目的 研究羥基紅花黃色素A(HSYA)對(duì)體外亞鐵血紅素/亞硝酸鈉/過氧化氫(heme/NaNO2/ H2O2)途徑引起腦組織蛋白質(zhì)硝基化的抑制作用。方法 模擬體內(nèi)heme/NaNO2/H2O2硝基化途徑，分別以牛血清白蛋白和腦組織蛋白為硝基化底物，分為對(duì)照組及藥物干預(yù)組，HSYA的終濃度依次為0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L。以Western blotting法檢測(cè)蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化水平。結(jié)果 Heme/NaNO2/H2O2途徑可引起牛血清白蛋白和腦組織蛋白顯著的硝基化修飾，加入不同濃度HSYA后，蛋白質(zhì)硝基化水平均呈劑量依賴性地降低，其中以1mmol/L HSYA的抑制作用最明顯，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。結(jié)論 HSYA可劑量依賴性地抑制heme/NaNO2/H2O2途徑在體外對(duì)腦組織蛋白的硝基化修飾;提示HSYA抑制蛋白質(zhì)硝基化反應(yīng)可能是其對(duì)抗腦血管疾病與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的分子機(jī)制之一。

羥基紅花黃色素A;亞鐵血紅素;蛋白質(zhì)硝基化

氧化應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化防御系統(tǒng)的平衡遭到破壞，體內(nèi)生成過多的高活性分子如活性氧自由基(reactire oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)會(huì)導(dǎo)致氨基酸殘基氧化修飾及改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，引起組織損傷。3－硝基酪氨酸(3－nitrotyrosine，3－NT)作為RNS攻擊蛋白質(zhì)酪氨酸的產(chǎn)物，它的產(chǎn)生被認(rèn)為是體內(nèi)蛋白質(zhì)硝基化的標(biāo)志［1，2］。研究表明，體內(nèi)蛋白質(zhì)硝基化的兩條主要通路包括過氧亞硝基離子(peroxynitrite，ONOO－)依賴途徑和亞鐵血紅素/亞硝酸鈉/過氧化氫(heme/NaNO2/H2O2)途徑［1］。目前，對(duì)ONOO－依賴途徑關(guān)注較多，而對(duì)heme/NaNO2/H2O2途徑研究較少，但是在生理病理?xiàng)l件下，究竟哪種途徑起主要作用，還未有結(jié)論。紅花為菊科植物紅花(Carthamus tinctorius L)的干燥花，是傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥。目前認(rèn)為，紅花活血化瘀的主要成分集中在水溶性的黃色素部分，紅花黃色素中含量最高且具有活性的成分為羥基紅花黃色素A(Hydroxysafflower yellow A，HSYA)［3］。研究表明，HSYA具有心腦血管保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制血小板聚集、抗氧化應(yīng)激等作用有關(guān)［4～6］。本研究通過體外構(gòu)建heme/NaNO2/H2O2硝基化途徑，觀察該途徑能否產(chǎn)生腦組織蛋白質(zhì)硝基化修飾以及HSYA對(duì)該途徑引起的蛋白質(zhì)硝基化是否具有抑制作用，為HSYA在預(yù)防和治療腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病等領(lǐng)域提供分子機(jī)制方面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠20只，體重340±10g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分籠喂養(yǎng)，于室溫、自然光環(huán)境下給予充足的食物和水，自然晝夜循環(huán)。所有動(dòng)物均于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1w后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑和藥品 (1)一抗:鼠抗硝基酪氨酸單克隆抗體(工作濃度為1∶1000)購(gòu)自美國(guó)Cayman Chemical公司;鼠抗甘油醛－3－磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(工作濃度為1∶1000)購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。(2)二抗:辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(工作濃度為1∶2500)購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。(3)其他試劑和藥品:氯化高鐵血紅素(ferriprotoporphyrin IX，Hemin)和牛血清白蛋白(BSA)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，Hemin溶于二甲亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司)溶液中，儲(chǔ)存液濃度為10mmol/L，使用時(shí)以濃度為0.1mmol/L的氫氧化鈉稀釋至所需工作濃度，避免反復(fù)凍融;苯甲基磺酰氟(PMSF)為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;考馬斯亮蘭R－250為美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品;Super ECL Plus超敏發(fā)光液為美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜為美國(guó) Millipore公司產(chǎn)品;羥基紅花黃色素 A (Hydroxysafflor yellow A，HSYA)凍干粉由浙江永寧藥業(yè)股份有限公司惠贈(zèng);過氧化氫(H2O2)、亞硝酸鈉(NaNO2)均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 恒溫水浴箱購(gòu)自德國(guó)Julabo公司;Western blotting電泳與轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)為美國(guó)BIO－RAD公司產(chǎn)品;低溫超速離心機(jī)為德國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品;凝膠成像儀為美國(guó)Syngene公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 (1)對(duì)照組:反應(yīng)底物為組織蛋白或BSA，反應(yīng)體系為hemin、NaNO2、H2O2; (2)低、中、高3個(gè)藥物濃度干預(yù)組:在對(duì)照組的基礎(chǔ)上分別加入終濃度為0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L的HSYA。

1.2.2 組織蛋白提取 SD大鼠處置前12h禁食，自由飲水。10%水合氯醛麻醉后斷頭處死，冰盒內(nèi)快速分離大腦和心臟，用4℃生理鹽水漂洗組織，并仔細(xì)去除蛛網(wǎng)膜，用濾紙吸干組織表面的液體。組織稱重后，切碎置于4℃磷酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH 7.4)中，并加入PMSF(終濃度為0.2mmol/L)，于冰上研缽充分研磨，靜置30min，4℃13000r/min離心15min，取上清備用。Lowry法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

1.2.3 體外heme/NaNO2/H2O2途徑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)硝基化 Heme/NaNO2/H2O2反應(yīng)體系:Hemin 100μmol/L、NaNO210mmol/L、H2O21mmol/L。不同濃度的 HSYA(終濃度分別為 0、0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L)與BSA(終濃度為2mg/ml)或組織蛋白(終濃度為9mg/ml)37℃水浴預(yù)孵育5min，之后加入heme/NaNO2/H2O2反應(yīng)體系，繼續(xù)37℃水浴孵育30min，取出冰上終止反應(yīng)。

1.2.4 Western blotting法檢測(cè)3－NT表達(dá) 上述反應(yīng)液按照蛋白樣品體積與4×上樣緩沖液體積為3:1的比例加入4×上樣緩沖液，混合后煮沸15min，冰上冷卻。取50μg蛋白樣品上樣，于體積分?jǐn)?shù)為10%十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)中分離，初始階段維持電壓80V，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠時(shí)電壓調(diào)至150V，至溴酚藍(lán)跑出分離膠時(shí)終止電泳。轉(zhuǎn)至PVDF膜上，80V電壓共轉(zhuǎn)膜80min。磷酸鹽緩沖液沖洗PVDF膜10min(×3次)，5%脫脂奶粉室溫封閉2h;加入一抗(鼠抗硝基酪氨酸單克隆抗體)，于4℃孵育過夜;PVDF膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，磷酸鹽緩沖液沖洗5min(×3次)。Super ECL Plus超敏發(fā)光液按照比例(1∶1)混合后加于PVDF膜上，在凝膠成像系統(tǒng)中激發(fā)，采集圖像。磷酸鹽緩沖液沖洗顯影后的PVDF膜5min(×3次)，浸于10ml洗脫緩沖液［含62.50mmol/L Tris－HCI(pH值6.80)，體積分?jǐn)?shù)為2%十二烷基磺酸鈉(SDS)，100mmol/L β－巰基乙醇］，55℃恒溫水浴箱孵育35min，磷酸鹽緩沖液沖洗5min(×3次)，以GAPDH作為內(nèi)參照物，檢測(cè)步驟同上。Quantity One凝膠圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析，目的蛋白質(zhì)灰度值與參照物灰度值進(jìn)行對(duì)比。組織蛋白選用GAPDH作為內(nèi)參照物;而BSA電泳后的凝膠則用考馬斯亮蘭著色以測(cè)定其上樣總蛋白量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，兩樣本均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn);多個(gè)樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD－t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSYA對(duì)體外heme/NaNO2/H2O2途徑引起B(yǎng)SA硝基化的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，BSA在 heme/NaNO2/H2O2反應(yīng)體系(hemin 25μmol/L、NaNO25mmol/L、H2O21mmol/L)中孵育30min可被顯著硝基化，分別加入 0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L HSYA，可不同程度地抑制該硝基化(Nitro－BSA)反應(yīng)，以1mmol/L HSYA的抑制作用最明顯(見圖1)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05，見表1)。

2.2 HSYA對(duì)體外heme/NaNO2/H2O2途徑引起腦組織蛋白質(zhì)硝基化的影響 以Western blotting法檢測(cè)腦組織蛋白質(zhì)體外硝基化水平，同時(shí)以心肌組織蛋白質(zhì)作為對(duì)照。結(jié)果顯示，在與BSA相同的heme/NaNO2/H2O2反應(yīng)體系中，腦組織蛋白質(zhì)未顯示硝基化反應(yīng)，但心肌組織可檢測(cè)到3－NT的存在，1mmol/L HSYA可抑制心肌蛋白質(zhì)硝基化反應(yīng)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見圖2、表2)。之后進(jìn)一步增加heme/NaNO2/H2O2體系的反應(yīng)濃度(hemin 100μmol/L、NaNO210mmol/L、H2O21mmol/L)，腦組織可檢測(cè)到大量3－NT的存在;分別加入 0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L HSYA，可不同程度地抑制該硝基化反應(yīng)，以1mmol/ L HSYA的抑制作用最明顯(見圖3)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05，見表3)。

圖1 HSYA對(duì)體外heme/NaNO2/H2O2途徑引起B(yǎng)SA硝基化的影響

圖2 HSYA對(duì)體外heme/NaNO2/H2O2途徑引起心肌組織蛋白質(zhì)硝基化的影響

圖3 HSYA對(duì)體外heme/NaNO2/H2O2途徑引起腦組織蛋白質(zhì)硝基化的影響

表1 不同濃度HSYA干預(yù)后Nitro－BSA表達(dá)水平的比較(±s，相對(duì)灰度值)

表1 不同濃度HSYA干預(yù)后Nitro－BSA表達(dá)水平的比較(±s，相對(duì)灰度值)

組間兩兩比較行LSD－t檢驗(yàn):(1)∶(2)～(1)∶(4)P均= 0.000;(2)∶(3)P=0.001;(2)∶(4)與(3)∶(4)P均=0.000

組別 樣本例數(shù) Nitro－BSA F值 P值對(duì)照組(1)低濃度組(2)中濃度組(3)高濃度組(4) 5 5 5 5 2.31±0.06 1.55±0.09 1.37±0.05 0.74±0.05 490.852 0

表2 HSYA干預(yù)后心肌組織3－NT表達(dá)水平的比較(±s，相對(duì)灰度值)

表2 HSYA干預(yù)后心肌組織3－NT表達(dá)水平的比較(±s，相對(duì)灰度值)

組別 樣本例數(shù) 3－NT t值 P值對(duì)照組HSYA干預(yù)組5 5 21.68±1.36 15.40±1.24 7.599 0

表3 不同濃度HSYA干預(yù)后腦組織3－NT表達(dá)水平的比較(±s，相對(duì)灰度值)

表3 不同濃度HSYA干預(yù)后腦組織3－NT表達(dá)水平的比較(±s，相對(duì)灰度值)

組間兩兩比較行LSD－t檢驗(yàn):(1)∶(2)P=0.002;余P均= 0.000

組別 樣本例數(shù) 3－NT F值 P值對(duì)照組(1)低濃度組(2)中濃度組(3)高濃度組(4) 5 5 5 5 16.70±1.25 14.50±1.03 11.58±0.89 0.45±0.09 302.633 0

3 討論

Heme/NaNO2/H2O2途徑是蛋白質(zhì)硝基化途徑之一，在該途徑中H2O2與NaNO2是使硝基化發(fā)生的必需物質(zhì)［7］;heme的主要成分為原卟啉IX和鐵，而鐵是其發(fā)揮催化作用的關(guān)鍵物質(zhì)［7～9］，在體內(nèi)主要存在于血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素類物質(zhì)、過氧化物酶等含鐵卟啉的蛋白質(zhì)中。Hemin為heme的氧化形式，具有同樣的催化蛋白質(zhì)硝基化的作用［7］。BSA為牛血清中分子量為68kDa的球蛋白，成分比較單一，而腦組織中蛋白質(zhì)成分復(fù)雜，含有抗氧化與促氧化等物質(zhì)，因此，我們?cè)隗w外構(gòu)建heme/ NaNO2/H2O2硝基化途徑，首先研究HSYA對(duì)BSA硝基化的抑制作用，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究HSYA對(duì)腦組織蛋白質(zhì)硝基化的抑制作用。

本研究結(jié)果顯示，BSA在 heme/NaNO2/H2O2反應(yīng)體系中可被硝基化修飾;腦組織在該反應(yīng)體系中也可被硝基化，且表現(xiàn)為多種分子量的蛋白質(zhì)均可被硝基化。該結(jié)果提示，heme/NaNO2/H2O2途徑可能參與了病理情況下腦組織蛋白質(zhì)的硝基化修飾。Heme具有親脂性和較強(qiáng)的促硝基化效應(yīng)，極易滲透細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜，造成脂質(zhì)、DNA、細(xì)胞骨架的損傷［10］。大量研究表明，在發(fā)生出血性卒中、出血性腦梗死、顱腦創(chuàng)傷、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病等病理情況下，局部過量蓄積的 heme具有神經(jīng)毒性［10～19］。在發(fā)生出血性卒中后，富含血紅蛋白的紅細(xì)胞在病變局部蓄積，其分解后釋放出大量的heme，同時(shí)在出血性卒中引發(fā)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下，NO2－與H2O2生成增多，使heme/NaNO2/H2O2途徑發(fā)生的可能性大大增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)硝基化修飾［15，16］。同時(shí)在某些神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病(如帕金森病、阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化等)中神經(jīng)元蛋白質(zhì)硝基化也可能部分與heme或含heme的蛋白有關(guān)［17～19］。同時(shí)在這里值得提出的是，在與BSA相同的heme/NaNO2/H2O2反應(yīng)體系中，腦組織蛋白質(zhì)未顯示硝基化修飾，而心肌組織中可檢測(cè)到3－NT，可能與心肌組織本身富含肌紅蛋白有關(guān)。

在本研究中，HSYA對(duì)BSA和腦組織蛋白質(zhì)的硝基化修飾具有抑制作用，且該作用呈劑量依賴性;提示HSYA對(duì)heme/NaNO2/H2O2途徑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)硝基化反應(yīng)具有抑制作用。目前研究認(rèn)為，3－NT的生成是一種特殊的氧化反應(yīng)［1，20］，因此應(yīng)用抗氧化劑通常是抑制自由基、鐵介導(dǎo)的蛋白質(zhì)硝基化的策略［8］。HSYA屬于黃酮類物質(zhì)中的查爾酮類，其分子中含多個(gè)酚羥基，而后者已被證明具有清除羥自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等抗氧化功能［21］。因此推測(cè)，HSYA抑制heme/NaNO2/H2O2途徑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)硝基化可能為其酚羥基的作用。與本研究結(jié)果相一致，黃酮類中的其他物質(zhì)(如黃芩素、槲皮素等)也被證明可抑制heme/NaNO2/H2O2途徑誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)硝基化［22］。據(jù)此，我們推測(cè)HSYA對(duì)蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化修飾的抑制作用與其抗氧化作用密不可分，這可能與其本身分子結(jié)構(gòu)和自由基清除能力有關(guān)。

綜上所述，羥基紅花黃色素A可劑量依賴性地抑制heme/NaNO2/H2O2途徑在體外對(duì)腦組織蛋白的硝基化修飾，提示這可能是其對(duì)抗腦血管疾病與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的分子機(jī)制之一。

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Study on the inhibitory effect of Hydroxysafflor yellow A to brain protein nitration in vitro

ZHAO Rui－jie，SUN Li，LIU Xing－miao，et al.(Department of Neurology，People’s Hospital of Xingtai，Xingtai054031，China)

ObjectiveTo study the inhibitory effect of Hydroxysafflor yellow A(HSYA)on brain protein nitration induced by heme/NaNO2/H2O2system in vitro.MethodTo simulate in vivo heme/NaNO2/H2O2system－induced nitrative pathway，with bovine serum albumin(BSA)and brain protein for nitrification substrates respectively，preincubated with or without HSYA(at final concentrations of 0.01，0.1，1mmol/L)at 37℃ for 5min，and then Hemin，NaNO2，H2O2were added，the mixture was further incubated at 37℃ for 30 min，which could be detectable by Western blotting using anti－nitrotyrosine antibody.ResultsHeme/NaNO2/H2O2system could induce significant protein tyrosine nitrative modification to BSA and brain protein in vitro.HSYA pretreatment showed a very strong capacity to dose－dependently inhibitionion in 3－nitrotyrosine formation，especially at highest concentration(1mmol/L)，the differences between with and without HSYA were statistically significant(P＜0.05，for all).ConclusionHSYA could dose－dependently inhibit brain protein nitrative modification induced by heme/NaNO2/H2O2system in vitro，which may be one of the molecular mechanisms to against cerebrovascular and neurodegenerative diseases.

Hydroxysafflor yeHow A;Heme;Protein nitration

Q51

A

1003－2754(2013)03－0204－04

2012－11－01;

2013－01－12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81070968)

(1.河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，河北 邢臺(tái)054031;2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院天津市神經(jīng)病學(xué)研究所，天津300052)

孫 莉，E－mail:sunli_2000@hotmail.com