袁 冬，闞春燕，高 鵬，杜丹華，吳 江

E－選擇素基因多態(tài)性與腦梗死相關(guān)性研究

袁 冬1，闞春燕1，高 鵬2，杜丹華1，吳 江1

目的 探討E－選擇素(E－selectin)及基因A561C多態(tài)性與腦梗死相關(guān)性。方法 以rs5361位點(diǎn)為遺傳標(biāo)記，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)檢測(cè)199例腦梗死組和124例對(duì)照組人群E－selectin基因的多態(tài)性。結(jié)果 腦梗死組與對(duì)照組的rs5361位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率在兩組中比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度分析，C等位基因攜帶者患腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)是A等位基因的5.4倍。腦梗死組AC+CC基因型頻率明顯高于對(duì)照組(P=0.00)。結(jié)論 E－selectin基因A561C多態(tài)性與腦梗死的發(fā)病相關(guān)，C等位基因可能是腦梗死發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。

E－選擇素;腦梗死;基因多態(tài)性

腦梗死(cerebral infarction，CI)因其具有高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特點(diǎn)，已成為嚴(yán)重危害人類健康的重要疾?。?］。傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素如吸煙、不良飲食習(xí)慣、血脂異常、高血壓、糖尿病等與腦梗死的發(fā)生有關(guān)。而近年來的遺傳學(xué)研究表明腦梗死的發(fā)生具有遺傳易患性。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)導(dǎo)致的腦梗死是最常見的類型，亦是腦血管疾病重要的病理基礎(chǔ)，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷則是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)。E－選擇素(E－selectin)是一種細(xì)胞粘附分子，可在損傷內(nèi)皮細(xì)胞的表面高度表達(dá)，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成［2］。因此，本研究選擇選擇素基因(EALM1)A561C作為動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的候選基因，通過對(duì)該基因多態(tài)性的研究，探討其與腦梗死之間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2011～2012年期間在吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的199例腦梗死患者作為病例組，其中男143例，女56例，年齡29～83歲，平均60.1±10.7歲，經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)檢查、TCD和頸動(dòng)脈超聲及頭部CT或MRI檢查，診斷為動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死，除外房顫、腫瘤等栓子來源的腦栓塞性疾病，除外肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病。并盡量收集完整的臨床資料，包括患者的一般情況(性別、年齡、民族、體重指數(shù)、腰圍、煙酒嗜好)、既往病史、家族史、血脂、血糖、血尿常規(guī)、腎功能、心電圖等。對(duì)照組來自吉林大學(xué)第一醫(yī)院體檢中心的健康體檢者，共124例，其中男97例，女27例，年齡25～87歲，平均58.2±8.2歲。經(jīng)病史詢問無腦血管病史，部分經(jīng)頭部CT或MRI證實(shí)。入組對(duì)象簽署知情同意書，并采集全血用于DNA提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 (1)標(biāo)本采集:抽取患者、對(duì)照者空腹外周靜脈血置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)基因組DNA的提取:采用Wizard基因組DNA提取試劑盒(美國Promega公司)抽提基因組DNA。(3)基因組DNA濃度與純度測(cè)定:用ND－1000紫外/可見光分光光度計(jì)(NanoDrop，美國)進(jìn)行定量測(cè)定，調(diào)整模板DNA濃度在25－50ng/μl。(4)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):基因引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，其核苷酸序列如下:上游引物:5’－TATGACACCATCTGCACCAG－3’，下游引物:5’－GCACAGTAATAGTCCTCCTC－3’。 反 應(yīng) 體 系(20μl):DNA模板1μl、PCR引物2μl(上游引物、下游引物各1μl)、2×Taq DNA Starmix 10μl、ddH2O 7μl。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 2min，變性94℃30s，退火52℃ 30s，延伸72℃ 30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃5min。(5)PCR產(chǎn)物的檢測(cè):取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2μl進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國)下觀察結(jié)果。(6)限制性核酸內(nèi)切酶酶切:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 15μl，PstI(MBI Fermentas)0.7μl，10×Buffer 2μl，BSA 0.2μl。37℃溫育箱孵育10h。(7)電泳判斷基因型:酶切產(chǎn)物加樣在含花青素、濃度為2%的瓊脂糖凝膠上電泳，電壓為115V，電泳35min，經(jīng)凝膠成像與分析系統(tǒng)觀察電泳圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用擬和優(yōu)度檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組基因型頻率的分布是否符合Hardy－Weinberg(H－W)平衡;UNPHASED遺傳學(xué)軟件應(yīng)用cocaphase對(duì)等位基因頻率進(jìn)行分析，SPSS 15.0軟件應(yīng)用卡方檢驗(yàn)對(duì)基因型頻率進(jìn)行分析。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E－selectin基因型分析 EALM1基因rs5361位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為266bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶PstI酶切片段的情況，基因型有3種，AA型(199bp，66bp 2條帶)，AC型(266bp，199bp，66bp 3條帶)，CC型(266bp 1條帶)(見圖1、圖2)。

2.2 腦梗死組與對(duì)照組E－selectin基因型及等位基因頻率比較 擬和優(yōu)度檢驗(yàn)表明病例組(χ2= 18.152，P=0.00)和對(duì)照組(χ2=17.887，P=0.00)的基因型分布均未偏離H－W平衡，說明該群體為隨機(jī)婚配。E－selectin A561C基因型在兩組的分布差異具有顯著性(χ2=18.152，P＜0.05，95%CI:2.57～12.85)，AC+CC基因型患腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型的5.75倍。cocaphase分析表明腦梗死組C等位基因頻率(11.8%)明顯高于正常對(duì)照組(2.4%)，差異有顯著性(OR=5.4，χ2=17.887，P＜0.05，95%CI:2.47～11.8)(見表1)。

圖1 EALM1基因A561C多態(tài)性2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

表1 腦梗死組與對(duì)照組E－selectin A561C基因型及等位基因頻率的分布

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是腦梗死最常見的病因。研究表明，AS可能是一種慢性炎癥狀態(tài)，且局部和全身炎癥反應(yīng)貫穿了從脂紋形成到斑塊破裂的全過程。E－selectin作為體內(nèi)的一種促炎細(xì)胞因子，與動(dòng)脈粥樣硬化的形成、高血壓、血脂異常等腦梗死高危因素之間關(guān)系密切。E－selectin能夠介導(dǎo)活化的內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的起始粘附，繼而介導(dǎo)白細(xì)胞活化，使白細(xì)胞在損傷區(qū)域滾動(dòng)，引起一系列炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致AS的形成［3］。因此，炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥的產(chǎn)生中起著重要作用［4］。

E－selectin即人類白細(xì)胞分化抗原CD62E，是選擇素家族(SF)成員之一，也是唯一僅表達(dá)于活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附分子(Ams)［5］。分子遺傳學(xué)的研究表明，EALM1位于1號(hào)染色體長臂，全長約13kb，由14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子大小22～189bp不等，內(nèi)含子長度106～1300bp不等，相對(duì)分子質(zhì)量為115kD，由589個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，是細(xì)胞表面的單鏈跨膜糖蛋白。通過對(duì)E－selectin進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)E－selectin基因存在著基因變異及基因多態(tài)性。

德國學(xué)者Wenze等l［6］在1994年發(fā)現(xiàn)E－selectin基因多態(tài)性只有在激活的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，并證實(shí)EALM1第4外顯子存在A561C基因多態(tài)性，認(rèn)為它可能影響E－selectin的生物活性及相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。

韋葉生等［7，8］對(duì)廣西壯族人群血清中EALM1 A561C基因多態(tài)性進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn) EALM1 A561C多態(tài)性與腦梗死的發(fā)病具有相關(guān)性，C等位基因可能是廣西地區(qū)壯族人群腦梗死發(fā)病的遺傳易感基因。同樣采用PCR分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)將腦梗死患者與正常人E－selectin基因型作比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦梗死患者E－selectin基因A561C多態(tài)性分布與正常人比較，差異具有顯著性(P＜0.05)，腦梗死患者E－selectin血清水平顯著高于對(duì)照者，與國外文獻(xiàn)［9］報(bào)道一致。為進(jìn)一步研究E－selectin基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性，我們采用PCR－RFLP技術(shù)檢測(cè)了199例腦梗死患者和124例正常人E－selectin基因型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦梗死患者EALM1 A561C多態(tài)性分布與正常人比較差異具有顯著性(P＜0.05)，其中攜帶AC+CC基因型個(gè)體患腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)約是AA基因型的5.75倍，提示C等位基因可能是腦梗死的遺傳易感基因，攜帶C等位基因的個(gè)體可促進(jìn)E－selectin的高度表達(dá)進(jìn)而增加罹患腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)，這與韋葉生等［7］報(bào)道相一致。

綜上所述，腦梗死是一種多基因遺傳和多環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜疾病，環(huán)境因素雖然可使其發(fā)病率增高，但遺傳因素在腦梗死發(fā)病機(jī)制中的地位仍不容忽視。E－selectin作為體內(nèi)的一種不可缺少的細(xì)胞粘附因子，具有表達(dá)的瞬時(shí)性及特異性［10］，它的功能日益受到重視。目前，關(guān)于腦梗死相關(guān)基因的研究還處在初級(jí)階段，還有待進(jìn)行大規(guī)模、多地域、多民族的系統(tǒng)研究，相信隨著對(duì)E－selectin研究的深入，必將給腦梗死的治療開辟更為廣闊的未來。

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Association study between a polymorphism of E-selectin gene and cerebral infarction

YUAN Dong，KAN Chunyan，GAO Peng，et al.(Department of Neurology，The First Hospital of Jilin University，Changchun130021，China)

ObjectiveTo detect the E－selectin and A561C gene polymorphism in patients with cerebral infarction. Methods Genotypes of E－selectin in 199 patients with cerebral infarction and 124 controls were typed by PCR－RFIP，SNPrs5361.ResultsThere was significant difference in frequencies of allele and genotype in E－selectin A561C polymorphism between patients group and control group(P＜0.05).Relative risk analysis indicated that the risk of cerebral infarction in C allele was 5.4 times higher than that in A allele.And the frequency of AC+CC genotypes in patients group was significant higher than control group(P=0.00).ConclusionE－selectin A561C polymorphism was associated with cerebral infarction，and C allele might be a risk factor of cerebral infarction.

E－selectin;Ccerebral infarction;Genes polymorphism

R743.3

A

1003－2754(2013)03－0208－03

2013－01－06;

2013－02－28

衛(wèi)生部臨床重點(diǎn)項(xiàng)目

(1.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130021;2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林長春130021)

吳 江，E－mail:sjnkwujiang@sina.com