魏傳晚 李 娟 劉又年＊,

(1中南大學化學化工學院，長沙 410083)(2南華大學化學化工學院，衡陽 421001)

近年來，多肽的自組裝逐漸成為分子生物學、化學、材料學和生物醫(yī)學等領(lǐng)域的研究熱點。1993年，Ghadiri等[1]設計并合成了含有8個氨基酸殘基的環(huán)多肽(cyclo-[(L-Gln-D-Ala-L-Glu-D-Ala)2-])，該環(huán)肽可以在水溶液中自組裝形成納米管狀結(jié)構(gòu)；同年，Zhang等[2]從酵母蛋白中發(fā)現(xiàn)了一組可自組裝形成水凝膠膜的離子互補型十六肽；隨后，一系列具有自組裝行為的多肽被國內(nèi)外科學家相繼報道。如Aggeli等[3]發(fā)現(xiàn)多肽分子之間的β-折疊結(jié)構(gòu)使多肽自組裝成規(guī)整的納米纖維；Gazit等[4-5]報道了二肽FF及其衍生物可以通過苯環(huán)間的π-π堆積作用自組裝形成納米管、納米空心球以及納米纖維等結(jié)構(gòu)；Krysmann等[6]發(fā)現(xiàn)七肽AAKLVFF能在甲醇溶液自組裝形成納米管，并指出苯丙氨酸殘基芳香環(huán)之間的π-π堆積對形成β-折疊具有重要作用，還提出雙層β-折疊螺旋卷曲形成納米管的模型；Lu和Lynn[7-8]發(fā)現(xiàn)KLVFFAE能自組裝形成β-折疊結(jié)構(gòu)為主的納米纖維和納米管；周慶翰等[9]設計了一種對稱結(jié)構(gòu)多肽，該多肽在水溶液中形成納米纖維結(jié)構(gòu)；王凈[10]合成了系列兩親性多肽，并發(fā)現(xiàn)A3K能自組裝形成層狀結(jié)構(gòu)；A6K自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)；而A9K自組裝形成納米短棒結(jié)構(gòu)；馬鑫等[11]合成了A6K的二倍體A6KA6K，其能在水溶液中自組裝形成納米囊泡狀結(jié)構(gòu)。

二茂鐵衍生物具有親脂性、高穩(wěn)定性、氧化還原性和多種生物(理)活性等特點而被廣泛應用于生物學、醫(yī)學、微生物學、材料學等領(lǐng)域[12-16]。近年來，我們課題組合成了多種二茂鐵-多肽化合物，并將其用于生物分子的檢測[17-19]、Aβ阻斷劑[20]、金屬離子檢測[21]以及單晶培養(yǎng)等領(lǐng)域[22]。此外，芳香族功能基還可作為疏水性基團引入到多肽鏈段的一端提供π-π堆積作用并被廣泛運用于兩親性多肽自組裝行為的研究[23-25]。

許多研究表明，阿爾茨海默氏癥 (Alzheimer′s disease)與 β-淀粉樣肽(Aβ)疏水核心片段(KLVFF)的β-折疊空間結(jié)構(gòu)所導致的淀粉樣沉淀聚集有關(guān)[26-28]。目前，未見用二茂鐵標記β-淀粉樣肽(Aβ)疏水核心片段進行自組裝的研究報道。在本研究中，我們將具有良好電化學特性[29]，且易與多肽、蛋白質(zhì)和DNA等結(jié)合的芳香化合物二茂鐵與Aβ疏水核心片段多肽相結(jié)合，得到以二茂鐵作為芳香端基的多肽，即 Fc-Lys(Z)-Leu-Val-Phe-Phe-OMe(Fc-KLVFF)，并利用透射電鏡、傅里葉紅外、紫外-可見和熒光光譜等方法對Fc-KLVFF在甲醇溶液中的自組裝行為進行研究，還采用電化學方法研究了Fc-KLVFF的電化學性能。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

本實驗所研究二茂鐵-多肽(Fc-KLVFF)的合成參照文獻[30]合成并經(jīng)過質(zhì)譜和核磁確證，二茂鐵-多肽Fc-KLVFF序列如圖1所示。甲醇為色譜純(美國Tedia公司)，其它試劑均為市售分析純試劑，去離子水使用Milli-Q純水儀制備。

AVATAR360傅里葉變換紅外光譜儀 (美國Nicolet公司)，電化學工作站(CHI-440，上海辰華儀器有限公司)，F(xiàn)-2500熒光分光光度計(日本Hitachi公司)，JEM-1230透射電子顯微鏡 (日本JEOL公司)。

將Fc-KLVFF溶解于甲醇溶液中，制成濃度為0．2%的甲醇溶液，密封并在避光的室溫條件下進行自組裝培養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1．2．1 透射電鏡

采用JEOL JEM-1230透射電鏡觀察自組裝的納米管的微觀結(jié)構(gòu),電鏡工作電壓為80～100 kV。取一滴Fc-KLVFF的甲醇溶液置于銅網(wǎng)格上，多余的溶液用無塵濾紙移除，空氣中風干約5 min，將銅網(wǎng)置于在透射電鏡下掃描。

1．2．2 電化學實驗

以玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲(Pt)電極為對電極。將化合物配成0．5 mmol·L-1的 DMSO 溶液， 緩沖液為 20 mmol·L-1的PBS 溶液(pH=7．4)，加入 0．1 mol·L-1的 NaCl溶液作為支持電解質(zhì)，進行循環(huán)伏安測試，掃描速度為0．05～1．0 V·s-1，掃描范圍為 0．4～0．8 V。

1．2．3 傅里葉紅外(FT-IR)光譜分析

FT-IR光譜分析采用AVATAR360傅里葉變換紅外光譜儀，分辨率為2 cm-1。采用空白KBr壓片液膜法測定樣品的紅外圖譜。先用滴有甲醇溶液的KBr薄片作為空白背景，然后將一片KBr片固定在樣品架上，將Fc-KLVFF的甲醇溶液樣品滴1～2滴于KBr片上，迅速蓋上另一塊片，固定好迅速放入儀器中進行FT-IR掃描。

1．2．4 熒光光譜

取0．05%Fc-KLVFF的甲醇溶液移入微量比色皿測試熒光光譜。激發(fā)波長(Ex)265 nm，光柵(Exand EmBandpass)5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物Fc-KLVFF的電化學性能研究

通過循環(huán)伏安法(CV)對合成的產(chǎn)物Fc-KLVFF的電化學性能進行測試，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，CV掃描結(jié)果 (掃描速率為 100 mV·s-1)，在0．4～0．8 V范圍內(nèi)出現(xiàn)了一對可逆的氧化還原峰，氧化峰和還原峰電位分別為0．544和0．626 V，峰電位之差 ΔEp=82 mV，峰電流密度之比 Ipa/Ipc=1．08，表明Fc-KLVFF在溶液中的良好的電子傳遞能力，該對氧化還原峰對應于Fc/Fc+的氧化還原反應過程。

在掃描速率為 0．05～1．0 V·s-1范圍內(nèi)， 陽極峰電流和掃描速率的平方根呈線性關(guān)系 (如圖2中插圖所示)，并根據(jù)方程(1)得出擴散系數(shù) D0=1．784×10-6cm2·s-1，表明相應的電化學過程主要受擴散控制[31]。

式中：R，普適常數(shù)；T，溫度；A，電極面積(cm2)；D0，擴散系數(shù)(cm2·s-1)；v，掃描速度(V·s-1)；C0，物質(zhì)初始濃度(mol·L-1)；F，法拉第常數(shù)；n，傳遞電子數(shù)。

2.2 光譜研究Fc-KLVFF的自組裝

室溫下以甲醇溶劑為溶劑，進行校零，測得Fc-KLVFF甲醇溶液的紫外可見吸收光譜圖，如圖3a所示。其中，210 nm峰是酰胺吸收峰，260 nm處是苯丙氨酸殘基苯環(huán)的吸收峰[6,32]，305 nm和 435 nm處則為二茂鐵的特征吸收峰(參見圖3中的插圖)[33-35]。260 nm處吸收峰較單個苯環(huán)的紫外吸收紅移了6 nm，且吸收強度增強，說明多肽鏈間存在芳香堆積作用。熒光光譜為自組裝的納米管多肽鏈間的芳香堆積作用提供了進一步的證據(jù)。在圖3b的熒光光譜中，290 nm處的強發(fā)射峰對應苯丙氨酸殘基苯環(huán)的π-π堆積作用[6,36]。311 nm處的弱峰是溶劑中痕量水的拉曼峰[37]。由此可見芳香環(huán)之間的ππ堆積作用在 Fc-KLVFF自組裝成納米管中起著重要作用。

蛋白質(zhì)和多肽的紅外吸收光譜的酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)可以反映其二級結(jié)構(gòu)的豐富信息，酰胺Ⅰ帶主要是氨基酸殘基的C=O伸縮振動吸收帶。從圖4可以看出，圖譜中只有酰胺Ⅰ帶附近有較強吸收峰，在1 630 cm-1處的較強吸收峰可指認為 β-折疊(pleatedβ-sheet)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的吸收峰[38-42]，我們推測Fc-KLVFF在甲醇溶液中自組裝成的納米管含有β-折疊結(jié)構(gòu)。而1 644～1 658 cm-1的強吸收峰可歸屬為樣品中痕量水或無規(guī)卷曲 (random coil)產(chǎn)生的吸收峰[40-42]，可能是Fc-KLVFF在自組裝過程中還有部分沒有自組裝成納米管，形成一些無序結(jié)構(gòu)聚集物的原因。

2.3 二茂鐵-多肽納米管的TEM及自組裝機制的研究

圖5為Fc-KLVFF在甲醇溶液中自組裝的TEM照片，從圖5(a～c)可以觀察發(fā)現(xiàn)Fc-KLVFF自組裝形成納米管狀結(jié)構(gòu)，在圖5(b)可以看到幾根并列緊靠在一起的多肽納米管，而在圖5(c)中可以觀察到一根管壁未完全封閉的多肽納米管。隨著孵育時間延長至3個月，多肽納米管的寬度相應增加(見圖5(d))。

經(jīng)過紫外、熒光、紅外光譜研究納米管二級結(jié)構(gòu)的實驗結(jié)果和透射電鏡圖片的綜合分析，發(fā)現(xiàn)Fc-KLVFF的自組裝機制類似于Lynn等[7-8]研究七肽KLVFFAE能自組裝形成的納米管時所建立的自組裝模型。結(jié)合Fc-KLVFF的結(jié)構(gòu)特點，我們推測二茂鐵-多肽自組裝的過程如圖6所示，首先Fc-KLVFF分子通過氨基酸殘基之間氫鍵作用形成β-折疊，β-折疊則可以繼續(xù)堆疊/層壓(stack/laminated)形成的 β-折疊片層(β-sheet lamination)如圖 6(b)所示[8]，然后 β-折疊片層采用一種“頭-尾”相接(end to end)的排列方式形成一個面積更大的β-折疊片層(圖6(c))，大β-折疊片層在多肽側(cè)鏈間的氫鍵和芳香堆積作用等作用力下螺旋卷曲 (helical wrapping)形成納米管(圖6(d))[6-8]。隨著納米管孵育時間的延長，F(xiàn)c-KLVFF可以繼續(xù)聚集到已長成的納米管上(圖6(e))，因此，多肽納米管的長度和寬度都相應增加，如圖5(d)所示?？赡苁欠跤^程中受到擾動等影響，大β-折疊片層出現(xiàn)了缺損，致使大β-折疊片層卷曲成的納米管中出現(xiàn)只有部分管壁的現(xiàn)象 (見圖5(c))，圖5(c)中這種管壁封閉不完全的現(xiàn)象，為我們提出的二茂鐵-多肽自組裝模型提供了實驗支持。

3 結(jié) 論

設計了一種新型的二茂鐵標記的β-淀粉樣肽(Aβ)疏水核心片段多肽Fc-KLVFF，對其進行了溶液電化學研究，發(fā)現(xiàn)其具有良好的電化學性能。通過TEM觀察到Fc-KLVFF在甲醇溶液中自組裝成納米管，利用紅外、紫外-可見和熒光光譜對納米管的二級結(jié)構(gòu)進行了研究，結(jié)果表明Fc-KLVFF通過分子間芳香殘基之間的π-π堆積作用和氨基酸殘基之間氫鍵的共同作用形成含有β-折疊的二茂鐵-多肽納米管，并推測出二茂鐵-多肽可能的組裝模型。為進一步研究神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過程提供了理論依據(jù)。二茂鐵-多肽納米管電化學性質(zhì)及應用研究正在進行中。

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