吳偉奮 陳春美 蘇德炎 高松齡 陳慶熙 韋 浩 王春華 楊衛(wèi)忠

1.福建醫(yī)科大學(xué)體育教研部，福建福州 350108；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，福建福州 350001

運動療法在腦梗死、偏癱康復(fù)治療一直在運動醫(yī)學(xué)界引起廣泛關(guān)注。前期研究證實，腦梗死后出現(xiàn)的神經(jīng)功能損失與一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）的表達有關(guān)[1-2]。研究腦缺血偏癱機制和治療的經(jīng)典動物模型是大鼠局灶性腦缺血模型，本研究采用線栓法閉塞大鼠右側(cè)大腦中動脈法（middle cerebral artery occlusion，MACO）建立局灶性腦缺血大鼠模型，其目的在于探討有氧運動促進減少神經(jīng)功能缺失和腦缺血后神經(jīng)細胞修復(fù)的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24 只健康成年雄性 SD 大鼠，體重（260±10）g，清潔級，來自浙江省實驗動物中心，標準嚙齒類飼料飼養(yǎng)且自由飲食，室內(nèi)溫度控制在20～24℃。

1.2 局灶性腦缺血大鼠模型的建立

大鼠分籠飼養(yǎng)，待其適應(yīng)1周后，腹腔注射麻醉（2%戊巴比妥鈉：35 mg/kg），參照Longa等[3]學(xué)者應(yīng)用線栓法閉塞大鼠右側(cè)大腦中動脈建立腦缺血大鼠模型。將其隨機分為對照組、疲勞運動組和有氧運動組，各組8只。

1.3 運動方式

有氧運動組和疲勞運動組均采用遞增強度方式進行跑臺運動，運動負荷參照Bedford等[4]的研究進行，有氧訓(xùn)練組每周5 d，共4周，起始速度為15 m/min，時間為20 min，遞增速度3 m/min、時間5 min，運動至速度為20 m/min，時間為60 min后增加跑臺坡度5%；疲勞訓(xùn)練組每周6 d，共4周，遞增速度3 m/min、時間5 min，運動至速度為35 m/min，時間為（60±10）min后增加跑臺坡度10%；對照組正常籠內(nèi)喂養(yǎng)，不運動。

1.4 神經(jīng)功能缺失評分

在規(guī)定的時間點時對每只大鼠進行神經(jīng)功能缺失評分，評分參考 Longa等[3]的方法，評分標準是：0分，沒有神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，向外側(cè)（左）轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.5 腦組織標本制作

在規(guī)定的時間點對每只造模成功的大鼠進行深度麻醉，然后用生理鹽水快速沖洗主動脈后，剪開大鼠頭部并暴露腦組織，快速把腦組織取出，然后包埋在冰中，在大鼠右側(cè)離額極2.5 mm處（右側(cè)額頂葉背外側(cè)皮質(zhì)和基底節(jié)）向后切取，稱重后，并按0.1 g每份分成數(shù)個等份，把其中的一份迅速置于電鏡固定液，剩余的-70℃冰箱保存，留著備用。

1.6 透射電鏡觀察腦缺血對腦組織結(jié)構(gòu)的影響

隨機從各組腦組織標本中各選取一份，用3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀進行后固定，然后用酒精-丙酮進行脫水，用環(huán)氧樹脂618包埋劑進行包埋；切成超薄切片，用醋酸鈾、檸檬酸鉛對其進行染色，最后應(yīng)用日立Hu-12A型（飛利浦208型）透射電鏡進行觀察、拍照。

1.7 腦組織NO含量和NOS活性的測定

隨機從各組腦組織各選取一份標本，標本上的血液用4℃預(yù)冷的生理鹽水洗凈，0.1 g勻漿，離心 10 min（4000 r/min），把分離得到的上清液分別用于NOS活性和NO含量的測定，按試劑盒說明書上的操作步驟進行操作。從武漢博士德試劑公司采購的NO硝酸還原酶法測定試劑盒，從南京建成生物工程公司采購的NOS活性測定試劑盒。

1.8 RT-PCR半定量分析eNOS、nNOS和iNOS基因在腦組織中的表達特點

從各組腦組織標本中各隨機抽取一份，RNA用Trizol試劑抽提，并計算總RNA濃度，稱重2 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，再將2 μL的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液作為模板，并在其中加入引物（β-actin，內(nèi)參照）進行 PCR擴增，總反應(yīng)體積 50 μL。選用的引物分別為eNOS（F5′-AGAGCATACCCGCACTTCTG-3′；R5′-GGAAGTAAGTGAGAGCCTGG-3′），nNOS （F5′-ACAAAGGAATGAATCCGTGCC-3′；R5′-GGCAGGAGGATCCAGTTAG-GA-3′），iNOS （F5′-CACGGAGAACAGCAGAGTTGG-3′；R5′-TTGTGGTGAAGGGTGTCGTG-3′），β-actin（F5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCCT-3′；R5′-GGATAGCACAGCCTAGATAG-3′）。 擴增條件：先用高溫94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，接著按（eNOS：58℃；nNOS：55℃；iNOS：55℃）復(fù)性 30 s，72℃延伸1 min（上述各步驟循環(huán)35次），最后72℃繼續(xù)延伸7 min。用1.8%瓊脂糖凝膠電泳和美國伯樂BIO－RAD Gel DocTMXR凝膠成像系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進行觀察和照相，獨立重復(fù)4次實驗，并用β-actin內(nèi)參照作為內(nèi)標，然后與同步產(chǎn)物進行比較，定量PCR產(chǎn)物，應(yīng)用Quantity-one分析軟件進行半定量分析，該基因mRNA的水平是通過計算所得產(chǎn)物的積分光密度與各自內(nèi)參照積分光密度的比值來反映的。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺失評分

對照組、有氧運動組和疲勞運動組的神經(jīng)功能缺失評分分別為（1.64±0.25）、（0.75±0.15）分和（2.85±0.33）分，三組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 透視電鏡觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)

對照組（圖1）的細胞形態(tài)及細胞核不規(guī)則；有氧運動組（圖2）細胞形態(tài)和細胞核不僅規(guī)則，而且細胞表面微絨毛豐富，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體等細胞器也增多；疲勞運動組（圖3）細胞核分裂，細胞質(zhì)中可見線粒體腫脹明顯，甚至產(chǎn)生空泡狀變。

2.3 腦組織NO含量和NOS活性的測定結(jié)果

有氧運動組NO含量和NOS的活性均高于對照組，但低于疲勞運動組，三組之間差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 見表1。

表1 各組腦組織NO含量和NOS活性的變化（±s）

表1 各組腦組織NO含量和NOS活性的變化（±s）

注：與對照組比較，t=15.179，*P<0.01，t＝ 7.060，△P<0.01；與有氧運動組比較，t＝ 21.503，▲P<0.01，t＝ 16.667，#P<0.01

對照組有氧運動組疲勞運動組888 0.27±0.01 0.39±0.02*0.56±0.03▲0.44±0.02 0.53±0.03△0.78±0.03#組別 例數(shù) NO含量變化（μmol/g） NOS活性 （nmol/min）

2.4 RT-PCR半定量分析NOS基因結(jié)果

各小組腦組織標本提取的總RNA λ值（OD260/OD280）在1.80～1.97之間，凝膠電泳圖顯示RNA沒有降解，RT-PCR產(chǎn)物的電泳完后，結(jié)果顯示eNOS、iNOS、nNOS和內(nèi)參照β-actin的特異性片段大小分別為625、342、501 bp和250 bp，三種NOS基因與內(nèi)參照比值在各小組之間表達不一：有氧運動組與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；疲勞運動組與有氧運動組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），三組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明隨著運動量的增加，NOS基因的表達量也隨之增加。見表2。

表2 各組腦組織NOS基因表達變化（±s）

表2 各組腦組織NOS基因表達變化（±s）

注： 與對照組比較，t=10.119， ①P<0.01，t＝24.000， ②P<0.01，t=4.707， ③P<0.01，t＝ 12.649， ④P<0.01，t=12.522， ⑤P<0.01，t＝16.282， ⑥P<0.01； 與 有 氧 運 動 組 比 較 ，t ＝ 14.000，1）P<0.01，t ＝2.000，2）P<0.01，t＝13.131，3）P<0.01

對照組有氧運動組疲勞運動組888 0.19±0.01 0.43±0.02①0.29±0.02④1）0.21±0.01 0.32±0.03②0.35±0.03⑤2）0.37±0.02 0.43±0.02③0.68±0.05⑥3）組別 例數(shù) eNOS nNOS iNOS

3 討論

缺血性腦損傷是目前發(fā)病率、致殘率和病死率均較高的嚴重疾病之一，約占全部腦血管病的80%，腦缺血疾病常常出現(xiàn)肢體偏癱等并發(fā)癥，如何改善腦缺血疾病的并發(fā)癥成為運動醫(yī)學(xué)和康復(fù)醫(yī)學(xué)的研究熱門課題之一。同時，建立一種生理指標控制嚴格、操作簡便、穩(wěn)定可靠且重復(fù)性好、與人類腦缺血病理過程相似的理想腦缺血動物模型，對腦缺血病理機制和治療的研究至關(guān)重要。缺血性腦血管病中由大腦中動脈閉塞（MCAO）引起者占絕大多數(shù)，所以，大腦中動脈閉塞所致局灶性腦缺血模型的研究也是學(xué)者們研究的重點。由于Longa線栓法具有創(chuàng)傷小、不開顱、模型成功率高、偏癱癥狀接近臨床等特點，是目前應(yīng)用最廣泛的腦缺血動物模型方法[3]。本實驗采用Longa線栓法建立的大鼠局灶性腦缺血模型后，大鼠具有以下癥狀：手術(shù)對側(cè)以前肢為主的偏癱；手術(shù)側(cè)眼球內(nèi)陷，瞳孔縮小，眼裂變??；術(shù)后大鼠運動時身體向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)，靜止后尾巴呈特殊的盤繞狀及體重下降等現(xiàn)象。這些癥狀的出現(xiàn)標志著成功建立了大鼠局灶性腦缺血模型，這是由于MCA供血區(qū)（包括頸上交感神經(jīng)通路和肌力及肌緊張的皮質(zhì)高級控制區(qū)）被阻塞，因此，大腦右側(cè)中動脈阻塞就出現(xiàn)上述相應(yīng)癥狀。同時，跑臺運動訓(xùn)練是腦缺血大鼠康復(fù)治療重要的實驗研究手段，大鼠跑臺運動訓(xùn)練方式的優(yōu)點主要有以下幾點：①運動方式符合大鼠日常的運動情況；②大鼠在各自的通道內(nèi)進行獨立運動，不會彼此干擾，使彼此之間的影響因素較少；③與游泳、運動轉(zhuǎn)鼓、跳臺等運動方式相比，跑臺運動可以更加精確地調(diào)控大鼠運動負荷、跑臺坡度和速度等。所以，本實驗研究選擇了跑臺運動訓(xùn)練作為大鼠的運動方式。

NO為體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子，與血管平滑肌舒張、心血管功能和神經(jīng)系統(tǒng)的病理和生理等過程密切相關(guān)[5-6]。NO在腦缺血中的病理生理作用主要包括NO的神經(jīng)保護作用和NO的神經(jīng)毒性作用。NO的神經(jīng)保護作用主要是通過增加腦血流、抗血小板和白細胞聚集黏附、增強突觸傳遞、阻斷N-甲基-D-天門冬氨酸 （NMDA）受體、抑制內(nèi)皮素（ET）生成以及神經(jīng)元對NOS的負反饋調(diào)節(jié)等機制起到對腦神經(jīng)的保護作用。腦缺血時生成過量的興奮性氨基酸（如谷氨酸），過度刺激NMDA受體，使細胞膜對Ca2+的通透性增加，胞內(nèi)鈣離子超載，進而引發(fā)一系列反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元壞死；同時鈣離子超載又激活磷脂酶、蛋白酶及NOS等多種酶，使NOS神經(jīng)元產(chǎn)生過量的NO，大量的NO又激活NMDA受體，使鈣離子通道活化，細胞外鈣離子涌入細胞內(nèi)，進一步加重神經(jīng)元損害[7]。此外，在腦缺血條件下，過量的NO還可以通過生成自由基、損傷線粒體等途徑發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。NOS是NO合成的限速酶，是調(diào)節(jié)NO的最重要環(huán)節(jié)。NOS有3種類型[8]：內(nèi)皮細胞型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS）、神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）。NO的雙重作用在腦缺血時比較短暫，以eNOS的表達為主，由血管內(nèi)皮細胞分泌eNOS而合成的NO，所產(chǎn)生的NO通過擴張腦血管，增加腦血流量，抑制血小板和白細胞聚集黏附，起到腦保護作用；而在腦缺血的中晚期，nNOS、iNOS起主要作用，通過介導(dǎo)谷氨酸毒性，生成氧自由基，影響細胞線粒體功能，增加炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡等途徑產(chǎn)生神經(jīng)毒性，nNOS表達量不高，而由梗死灶內(nèi)的吞噬細胞、炎癥細胞誘導(dǎo)所產(chǎn)生的iNOS，可以通過NOS、Caspase-3和p38MAPK等基因的相互關(guān)系介導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失[2，7，9]。

研究證實，運動訓(xùn)練能夠改善腦缺血患者肢體偏癱癥狀，婁淑杰等[10]建立腦缺血模型，證實跑臺運動則可進一步提高海馬的神經(jīng)再生水平，無論是缺血側(cè)還是健側(cè)，跑臺運動組動物海馬和齒狀回內(nèi)免疫陽性細胞數(shù)均明顯高于對照組動物。大量實驗已經(jīng)證實，運動訓(xùn)練可以促進大鼠神經(jīng)功能和體重恢復(fù)，減少大鼠腦梗死體積，有利于腦缺血大鼠的康復(fù)[11-12]。這些實驗結(jié)果與筆者的前期研究結(jié)果都是一致的，有氧訓(xùn)練增強大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)功能修復(fù)[13]，在本組實驗中，有氧運動組神經(jīng)功能缺失評分低于對照組，肢體活動能力康復(fù)效果好，說明有氧運動訓(xùn)練能夠改善腦缺血后偏癱。NO和NOS表達與不同運動強度相關(guān)，田振軍等[14]等同樣采用跑臺訓(xùn)練方式，建立了大鼠有氧運動和疲勞運動模型，不同強度運動大鼠腎臟皮質(zhì)區(qū)NOS的表達均有升高，運動誘導(dǎo)NO的生成增加，但大強度運動可促進大鼠腎臟皮質(zhì)區(qū)的細胞凋亡，且與NO大量生成有關(guān)。本實驗中，與對照組比較，有氧運動組和疲勞運動組NO和NOS均有不同程度的升高，但從電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)和神經(jīng)功能缺失的評分均可以發(fā)現(xiàn)，有氧運動組缺血神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)修復(fù)和神經(jīng)功能缺失改善明顯好于疲勞運動組，其機制可能是因為有氧運動能夠促進以保護神經(jīng)細胞的eNOS來源為主NOS表達升高，促進NO合成增加，擴張局部血管，改善缺血神經(jīng)細胞營養(yǎng)，促使缺血神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)[15-16]；相反，疲勞運動能組中大強度運動量引起以神經(jīng)毒性的iNOS來源為主NOS表達明顯升高，促進NO合成大量合成，NO的過度表達出現(xiàn)局部神經(jīng)細胞凋亡。

綜上所述，不同運動訓(xùn)練強度均能夠促進腦缺血區(qū)域NO和NOS的表達升高，有氧運動以促進發(fā)揮神經(jīng)保護作用的eNOS表達為主，建立側(cè)支循環(huán)，改善腦梗死局部區(qū)域血運，促進神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)修復(fù)和神經(jīng)功能的恢復(fù)，而疲勞運動使iNOS表達明顯升高，引起NO過表達，對局部神經(jīng)細胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性，出現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象，這對于應(yīng)用適宜運動強度治療腦缺血后偏癱有十分重要的意義。

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