劉 穎，王文多，陳 穎，張沛怡

黑龍江省醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150036

酒精性肝硬化(alcoholic liver cirrhosis，ALC)是長期大量飲酒導致的肝功能嚴重受損而引發(fā)的一組疾病的終末階段。此階段肝功能損傷不可逆并出現(xiàn)較多合并癥，治療效果不佳，死亡率高。故探討ALC的發(fā)病機制，研究ALC患者與正常人之間存在的差異基因及其在發(fā)病過程中發(fā)揮的生物學作用，對該病的基因治療具有深遠的意義。

本文研究2010年12月－2011年5月應用ALC患者及健康對照者外周血總RNA樣本及基因芯片技術，尋找ALC患者和健康對照者之間存在的差異基因，研究差異基因共表達網(wǎng)絡中的節(jié)點基因，并進一步探討它們的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 資料來源 收集ALC(診斷標準按中華醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組制定的酒精性肝病的診療指南)和同期門診健康對照者兩組(均簽署知情同意書)，每組10例，人體外周血10 ml，并提取單核細胞。

1.2 樣本RNA的提取與標記 (1)總RNA抽提及純化:采用Invitrogen?Trizol提取組織中的總RNA，純化好的RNA溶于DEPC水中并于－80℃冰箱保存。(2)樣品RNA質(zhì)量檢測:使用瓊脂糖凝膠電泳或Agilent2100 Bioanalyzer系統(tǒng)對樣品總RNA質(zhì)量進行完整性檢測分析。(3)雙鏈cDNA合成與純化:取500 ng總RNA，以T7-Oligo(dT)為引物，體外合成并純化雙鏈cDNA;純化的雙鏈cDNA于－20℃冰箱保存。(4)體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA與標記生物素:將雙鏈cDNA進行體外轉(zhuǎn)錄合成(擴增)cRNA并同時標記生物素，而后將其純化，純化的cRNA于－20℃冰箱保存。(5)合成cRNA質(zhì)量檢測。

1.3 探針定量 體外轉(zhuǎn)錄合成的生物素標記 cRNA用Molecular Probes’RiboGreen?kit進行定量檢測。

1.4 芯片雜交 (1)芯片雜交:取1.5 μg純化的生物素標記 cRNA溶于10 μl水中并加入緩沖液 GEXHYB，而后將其加到芯片中，將GEX-HCB放入蓄液槽后將芯片雜交盒放入58℃雜交爐中進行雜交。(2)雜交后處理:按Sentrix?BeadChip實驗手冊操作，將芯片溫育(EIBC溶液)、高溫漂洗、乙醇洗滌(100%乙醇)、封閉(E1 buffer)、Cy3染色、干燥等。

1.5 圖像掃描 用高精度激光共聚焦掃描儀(Illumina scanner:0.8 μm)對雜交后的芯片進行掃描及信號提取。

1.6 生物信息學數(shù)據(jù)處理 以正常樣品作對照，采用Illumina custom Error Model進行差異基因分析，然后選出P≤0.01的基因，系統(tǒng)化全基因組水平分析以識別出不同組之間的差異表達基因，結合Gene Ontology數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進行相關差異表達基因的功能分類和顯著路徑的分析。

2 結果

2.1 差異基因的篩選 因每組樣本在進行芯片掃描時分別有10個生物學重復，所以在篩選差異基因時，我們選擇適合小樣本數(shù)據(jù)的篩選方法—隨機方差模型進行兩組樣本間差異的篩選，利用隨機方差模型計算每個基因的顯著性水平(P value)和誤判率(FDR)，按照P＜0.05進行篩選，獲得差異表達的基因。兩組共發(fā)現(xiàn)1008個差異表達的基因。

2.2 差異基因功能的顯著性分析 雖然兩組間有1008個差異基因被發(fā)現(xiàn)，但并不是所有差異基因均參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程。基于Gene Ontology數(shù)據(jù)庫，得到差異基因的所有GO注釋。利用Fisher精確檢驗和卡方檢驗對每個GO進行顯著性分析，得到每個GO的顯著性水平(P value)，按照P＜0.05進行篩選，得到差異基因的顯著性功能。發(fā)現(xiàn)顯著性差異表達上調(diào)基因188個;下調(diào)基因210個。同理基于KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因進行Pathway的功能分析，按照P＜0.05篩選，得到顯著性表達差異基因參與的顯著性意義的pathway。其中上調(diào)pathway 14個，對應的基因47個(見圖 1);下調(diào) pathway 4個，對應基因 12個(見圖2)。

2.3 基因間的相互作用關系網(wǎng)絡 通過以上分析得到了差異基因在功能和信號通路上的調(diào)控機制，我們針對每個基因間的相互作用進行分析，構建得到基因間的調(diào)控網(wǎng)絡(見圖3)，基于差異基因間的相互作用網(wǎng)絡，通過對基因調(diào)控網(wǎng)絡中基因的Betweenness Centrality篩選，得到網(wǎng)絡中的節(jié)點基因。節(jié)點基因前4位是:mapk8、cxcr3、pdgfrb、calml5。下調(diào)基因為:mapk8、calml5;上調(diào)基因為:cxcr3、pdgfrb。

3 討論

雖然ALC的發(fā)病機制一直是消化內(nèi)科醫(yī)生研究的熱點，但具體機制不明確。前期研究發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生與細胞凋亡、免疫應答、脂質(zhì)過氧化物反應、乙醇代謝酶的基因多態(tài)性等因素有關［1-2］，但參與這些病理生理過程的具體基因未予以闡明。前期工作中，我們運用大鼠酒精性肝病的模型，研究了酒精性脂肪肝和肝纖維化階段差異表達的基因，但由于大鼠基因與人類存在著較大差異，這些結果并不能完全闡述人類酒精性肝病過程中各個階段致病作用的差異基因。

通過我們的研究，發(fā)現(xiàn)了ALC患者與健康對照者之間存在1008個差異表達的基因。其中顯著性差異表達的基因中上調(diào)基因188個，下調(diào)基因210個。其所參與的顯著性意義pathway中，上調(diào)pathway 14個，對應的基因47個;下調(diào)pathway 4個，對應基因12個。根據(jù)網(wǎng)絡中介中間性，差異基因共表達網(wǎng)絡中的節(jié)點基因前四位是:mapk8、cxcr3、pdgfrb、calml5。下調(diào)基因為:mapk8、calml5;上調(diào)基因為:cxcr3、pdgfrb。

其中mapk8—絲裂原激活的蛋白激酶8(mitogenactivated protein kinase 8)是差異基因共表達網(wǎng)絡中最重要的節(jié)點基因，其中介中間性最大，為0.449932，是下調(diào)基因。該基因編碼蛋白是蛋白激酶家族的一個成員，此激酶為多個生化信號傳導的結合點，并參與多種細胞過程，如增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)展［3-4］。通過其自身磷酸化及復雜的信號轉(zhuǎn)導，激活Ras蛋白，后者活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，MAPK是一類廣泛存在于真核細胞中具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶，被活化后可顯著增強c-fos和cjun基因的表達［5］，而兩者結合后的基因表達產(chǎn)物對DNA修復和細胞增生起積極作用并進一步在細胞凋亡的信號通路上發(fā)揮調(diào)控作用［6-7］。而細胞凋亡作用已經(jīng)在ALC的發(fā)病機制中得到了廣泛證實，MAPK8的持續(xù)下調(diào)，很可能使c-fos和c-jun結合受抑制，不利于DNA修復和細胞的正常增生，并使細胞凋亡過程失去正常的調(diào)控從而加速了肝細胞的凋亡。

趨化因子受體CXCR3是G蛋白偶連的跨膜受體，主要表達在T細胞、自然殺傷細胞活性上［8］，有的上皮細胞和一些內(nèi)皮細胞也表達CXCR3。CXCR3與配體結合后在誘導Ⅰ型輔助T細胞(Th1)遷移的同時又阻止Ⅱ型輔助T細胞(Th2)的遷徙。從而增強T細胞的分化效應。CXCR3與其配體CXCL9、CXCL10、CXCL11的結合，能引起細胞鈣離子的內(nèi)流，啟動肌醇磷脂3-激酶和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)。CXCR3調(diào)節(jié)白細胞遷徙，CXCR3與配體相互作用引起Ⅰ型輔助T細胞(Th1)的遷移，并促進Ⅰ型輔助T細胞(Th1)成熟。CXCR3可能在下列疾病中起作用，包括動脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化、肝纖維化。

其他差異表達的節(jié)點基因參與的生物學通路包括:細胞凋亡、生物信號傳導、堿基切除修補、核糖核酸酶代謝、結氨酸亮氨酸異亮氨酸降解、脂質(zhì)代謝吸收、免疫應答等?？梢娫贏LC的發(fā)病是一個眾多顯著性表達的差異基因參與諸多生物學反應獨立或關聯(lián)發(fā)生的極其復雜的病理生理過程。

我們的研究首次應用了ALC患者的外周血RNA，在前期大鼠的研究基礎上，揭示了ALC患者與健康對照者之間存在的顯著性表達的差異基因，并分析了其在酒精性肝硬化發(fā)病過程中的生物學作用，其結果還需更大的樣本來進一步的證實和比對。希望我們的工作為下一步的研究提供一個有效切入點，成為ALC的發(fā)病機制和基因治療新的分子生物學靶點。

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