吳小青 李英 謝曉蕊 安剛 王燕 徐兩蒲 林娜 何德欽 林元

（福建省婦幼保健院 產(chǎn)前診斷中心，福建 福州 350001）

隨著產(chǎn)前篩查工作的普遍開展以及優(yōu)生優(yōu)育觀 念的不斷深入人心，產(chǎn)前診斷技術(shù)已經(jīng)成為臨床醫(yī)學(xué)科學(xué)的重要組成部分，其中羊水以及絨毛細胞培養(yǎng)與染色體制備技術(shù)是產(chǎn)前診斷中極為重要的技術(shù)之一。自1966年首例羊水細胞培養(yǎng)成功至今［1］，該技術(shù)已經(jīng)非常成熟。國內(nèi)目前普遍應(yīng)用的是培養(yǎng)瓶-胰酶消化培養(yǎng)法，該法存在耗時長、操作繁瑣、細胞丟失大、無法區(qū)別真假嵌合等缺點。原位培養(yǎng)法則不存在以上缺點，能夠鑒別真假嵌合，但技術(shù)要求較高，在國內(nèi)一直無法得以推廣。本實驗室在國內(nèi)原位培養(yǎng)法研究的基礎(chǔ)上，借鑒國外的成功經(jīng)驗，采用原位培養(yǎng)載玻片法對早期絨毛、中期羊水進行培養(yǎng)處理，并結(jié)合染色體全自動掃描系統(tǒng)，自動按照克隆進行染色體掃描以供分析，大大提高了工作效率，現(xiàn)報告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年6～12月在本院行介入性產(chǎn)前診斷標本以及流產(chǎn)絨毛標本共130例，其中羊膜腔穿刺100例，孕周18～24周；絨毛標本30例，孕周11～14周，其中絨毛膜穿刺10例，流產(chǎn)絨毛20例。穿刺指征包括高齡、血清學(xué)篩查指標異常、胎兒超聲指標異常、異常生育史等。

1.2 主要試劑與儀器 羊水培養(yǎng)基、原位載玻片培養(yǎng)盒為杭州寶榮科技有限公司生產(chǎn)，培養(yǎng)瓶為丹麥Nunclon EasYFlask易用培養(yǎng)瓶。CO2培養(yǎng)箱為美國Thermo 3111型培養(yǎng)箱。倒置顯微鏡為Nikon TE2000-S。染色體分析儀為美國Genetix公司的GSL-120自動染色體掃描儀。

1.3 標本處理

1.3.1 羊水標本 無菌條件下抽取羊水30 ml，分別注入3個無菌離心管中，1500 rpm離心10 min，棄上清，每管留取0.3 ml制成細胞懸液。其中一管按常規(guī)培養(yǎng)瓶法接種培養(yǎng)。另2管各加入1 ml培養(yǎng)基，充分混勻后分別涂抹于4個原位培養(yǎng)盒的載玻片上，接種后置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后各補充4 ml培養(yǎng)基，接種后5天觀察。

1.3.2 絨毛標本 將絨毛組織在生理鹽水中洗滌，用無菌手術(shù)刀片切碎，取小米粒大小按常規(guī)培養(yǎng)瓶法培養(yǎng)。另取米粒大小加入培養(yǎng)基1 ml制成懸液，分別涂抹于2個原位培養(yǎng)盒的載玻片上，置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后各補充4 ml培養(yǎng)基，接種后5天觀察。

1.4 觀察、換液、收獲

1.4.1 原位培養(yǎng)載玻片法 第5天開始觀察，當羊水玻片上出現(xiàn)6～7個密度適中的克隆，絨毛標本玻片上大約7～8個組織塊周圍細胞生長，并有較多處于分裂期的圓形透亮細胞時便可收獲。收獲前一天換液，平均6～8天完成收獲。收獲過程：加40μl秋水仙素（100μg／ml）作用2小時，棄培養(yǎng)液，加37℃預(yù)溫的低滲液（1∶1，0.4%氯化鉀：0.4%檸檬酸三鈉）4 ml，低滲5分鐘，加1 ml固定液（3∶1甲醇∶冰醋酸）預(yù)固定10分鐘，棄低滲液，加4 ml固定液固定30分鐘，重復(fù)固定1次。取出玻片，置于37℃溫箱過夜，第二天80℃烤片2小時。

1.4.2 培養(yǎng)瓶法 第7天開始觀察，當出現(xiàn)10個左右大、中克隆，并且有大量處于分裂期的圓形透亮細胞時開始收獲，平均8～10天完成收獲。收獲過程按照常規(guī)胰酶消化法進行［2］。

1.5 核型分析 常規(guī)胰酶法G顯帶后的玻片置于GSL-120染色體全自動掃描系統(tǒng)進行克隆識別以及染色體掃描。先分析原位培養(yǎng)載玻片法的結(jié)果，培養(yǎng)失敗或者分析不夠時再結(jié)合分析培養(yǎng)瓶法的結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 原位培養(yǎng)載玻片法的100例羊水標本中，成功100例，其中異常4例，核型分別為2例46，XX，inv（9），1例47，XX，＋21，1例45，XY，rob（13；14）（q10；q10）；30例絨毛標本中，10例介入性產(chǎn)前診斷標本均培養(yǎng)成功，核型均正常；余20例流產(chǎn)絨毛中，成功17例，其中5例異常，核型分別為2例47，（XX／XY），＋16，1例47，XX，＋14，1例45，X，1例47，XX，＋3，未發(fā)現(xiàn)嵌合異常。

2.2 原位培養(yǎng)載玻片法周期較培養(yǎng)瓶法短，平均6～8天，培養(yǎng)瓶法平均8～10天。

2.3 每張載玻片上含有可供分析核型的克隆數(shù)約6～10個（如圖1），核型完整，分散良好（如圖2），顯帶清晰（如圖3），完全滿足臨床分析要求。

3 討 論

細胞培養(yǎng)是產(chǎn)前診斷技術(shù)中極為重要的技術(shù)之一。傳統(tǒng)的羊水及絨毛培養(yǎng)為培養(yǎng)瓶法，收獲過程采用胰酶消化法。由于在剝離細胞以及多次離心過程中不可避免造成細胞的損傷和丟失，最終造成分裂相的減少、核型不完整；此外，2次的胰酶消化對染色體顯帶的清晰度會有一定的影響。原位培養(yǎng)法較之傳統(tǒng)方法省去了細胞轉(zhuǎn)移、離心等步驟，大大減少了細胞的丟失及損傷，最終得到可供分析的核型較多。但國內(nèi)部分實驗室研究過程中曾用過培養(yǎng)瓶切割法、平皿蓋玻片法［3，4］，這2種方法的制片過程麻煩，保存不方便，更不能上機自動掃描分析，所以均無法得以推廣應(yīng)用；也有部分實驗室對玻片原位培養(yǎng)法［5］進行研究，但是在染色體的分散以及顯帶環(huán)節(jié)上仍存在一定的問題，且未能做到自動化核型掃描。本研究使用的原位培養(yǎng)盒中的載玻片是針對GSL-120染色體全自動掃描平臺設(shè)計的，顯帶完成后，直接利用該平臺的克隆識別功能，對載玻片上每個克隆選擇拍攝3個良好的中期分裂相供我們在電腦上進行核型分析診斷，無需顯微鏡下分析，大大減少了工作量。

圖1 A為原位培養(yǎng)載玻片法培養(yǎng)盒，B為羊水原位培養(yǎng)克隆分布，C為絨毛原位培養(yǎng)克隆分布

圖2 原位培養(yǎng)載玻片法的細胞克隆（10倍視野）

圖3 原位培養(yǎng)載玻片法的染色體核型（100倍視野）

本研究利用原位培養(yǎng)載玻片法對100例羊水及30例絨毛進行培養(yǎng)分析，除了3例絨毛培養(yǎng)失敗，其余均培養(yǎng)成功。培養(yǎng)失敗3例中有2例因接種過程污染導(dǎo)致，提醒我們在無菌操作上應(yīng)提高警惕，其余1例絨毛在原位載玻片以及培養(yǎng)瓶中均無貼壁細胞生長，可能是因所取組織不新鮮導(dǎo)致。實驗過程中鑒于制片時環(huán)境溫度和相對濕度對染色體的分散過程影響較大［6］，通過摸索，我們將制備好的玻片置37℃溫箱過夜，得到了很好的分散效果以及良好的染色體形態(tài)。在羊水培養(yǎng)方面，本研究方法所需羊水量少，培養(yǎng)周期短，在克隆較小時收獲，保證6～8個含有3個以上良好分裂相的克隆便可。根據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準的胎兒染色體異常的細胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷技術(shù)標準》規(guī)定，原位培養(yǎng)法分析時應(yīng)分別計數(shù)來自15個克隆的15個細胞，分析其中的5個核型，若不足15個克隆，則計數(shù)至少10個克隆，因此完全可以滿足臨床分析要求。

綜上所述，本研究優(yōu)化了原位培養(yǎng)法的實驗條件，結(jié)合染色體全自動掃描平臺，建立了條件穩(wěn)定、操作簡單、分析自動化的細胞原位培養(yǎng)載玻片法，在今后的產(chǎn)前診斷臨床工作中將有良好的應(yīng)用前景，值得推廣。

［1］Steele MW，Breg WR.Chromosome analysis of human amniotic-fluidcells［J］.Lancet，1966，1（6）：383-385.

［2］黃海龍，李英，徐兩蒲，等.1676例孕中期羊水細胞培養(yǎng)和染色體核型分析［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2009，26（6）：673-674.

［3］郝娜，許和，戚慶煒，等.平皿蓋玻片羊水細胞培養(yǎng)［J］.中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2002，5（3）：215-217.

［4］吳菁，鐘梅，郭莉，等.兩種羊水原位培養(yǎng)方法在產(chǎn)前診斷應(yīng)用評價［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2012，20（7）：74-75.

［5］譚美玉，龔波，俞菁，等.玻片原位培養(yǎng)在產(chǎn)前診斷中的初步應(yīng)用［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2011，19（9）：50-52.

［6］Ann Tabor，Anne-Mare Lind，Alice Milbrat Andersen，et al.A culture vessel for amniotic fluid cells allowing faster preparation of chromosome slides［J］.Prenatal Diagnosis，2005，4（6）：451-455.