丁鑒鋒 ，閆喜武，趙力強，楊 鳳，王連順，包鵬云

(1.大連海洋大學，大連 116023;2.遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心，大連 116023)

近年來，隨著沿海城市工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展，以及一些災害性事件的發(fā)生，導致沿海海域環(huán)境污染日趨加劇。另一方面，養(yǎng)殖海區(qū)自身也會產(chǎn)生一些污染物，結果導致淺海養(yǎng)殖海區(qū)環(huán)境惡化，嚴重影響了海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。菲律賓蛤仔是我國北方一種重要的灘涂養(yǎng)殖貝類，調查發(fā)現(xiàn):環(huán)境污染導致貝類的免疫能力降低，加之高溫季節(jié)有害菌的大量繁殖，可能是夏季養(yǎng)殖蛤仔大規(guī)模死亡的重要原因之一［1］。

因此，本研究旨在通過比較不同海區(qū)的污染物對蛤仔免疫能力的影響，探討蛤仔大規(guī)模死亡的原因，為菲律賓蛤仔養(yǎng)殖業(yè)的綠色、健康和可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

圖1 采樣點地圖Fig．1 Map of Dalian showing the four sites where clams were collected

1 材料與方法

1.1 樣品采集

測定用菲律賓蛤仔采至大連周邊海區(qū):皮口、登沙河、莊河和黑石礁海區(qū)(圖1)。

1.2 蛤仔體內(nèi)污染物含量的測定

蛤仔體內(nèi)污染物含量委托國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心(大連)進行測定，測定結果如表1所示。

1.3 血淋巴細胞樣品制備

取各采樣點蛤仔樣品30個，使用1mL無菌注射器從菲律賓蛤仔圍心腔中分別抽取血淋巴200μL，將6個蛤仔的血淋巴混合加入1.5mL樣品管作為一個測定樣品，并置于冰上保存，待后續(xù)實驗測定。

1.4 肥滿度指數(shù)(CI)測定

記錄采血后蛤仔個體殼長，并將軟組織剝離放入烘箱中，60℃烘干18h，測定組織干重并計算CI值。

表1 各海區(qū)蛤仔體內(nèi)污染物含量Table1 Contaminant concentrations in clam tissue from different sea area

1.5 血細胞總數(shù)測定(THC)

吸取30μL血淋巴細胞樣品加入到等量的BFC固定液中，固定后樣品加到血球計數(shù)板上，在10倍光學顯微鏡下觀察計數(shù)。

BFC固定液:NaCl 2%，乙酸鈣1%，甲醛4%。

1.6 細胞膜穩(wěn)定性

取50μL血淋巴細胞樣品加入酶標板中，4℃孵育45min;用生理鹽水洗去未粘附血細胞(100μL×2);加入200μL 0.004%中性紅20℃孵育3h;用生理鹽水洗去多余染料;再分別加入200μL酸化酒精破壞細胞膜及重新溶解中性紅;將酶標板放入酶標儀中OD550讀取數(shù)值。表示方法:每毫克蛋白對應的吸光度值變化。

1.7 血細胞吞噬活性

血細胞吞噬活性采用Hannam等人［2］的方法，取50μL血淋巴細胞樣品加入到96孔酶標板中，4℃孵育1h;用100μL貝類生理鹽水洗去未粘附血細胞2次;加入50μL中性紅染過的酵母懸液(50×107個/mL);20℃孵育30min后，加入100μL BFC終止反應;多余的酵母顆粒用生理鹽水洗去，加入100μL酸化酒精，置于酶標儀中，使用OD550nm讀取吸光度值?；钚员硎痉椒?每毫克蛋白所吞噬的酵母顆粒數(shù)。

酵母標準曲線的制備:取50μL 酵母顆粒(濃度分別為6.25、12.5、25、50、100×107個/mL)，加入等量酸化酒精，OD550nm讀取吸光度值，用酵母濃度與吸光度值作標準曲線。

貝類生理鹽水配方:0.02mol/L HEPES，0.4mol/L NaCl，0.1mol/L MgSO4，0.01mol/L KCl，0.01mol/L CaCl2，調 pH 為 7.4。

酸化酒精配方:醋酸1%，酒精20% 。

1.8 酚氧化活性

酚氧化酶采用Zhang等人改進的方法，以L-dopa為底物，胰蛋白酶為誘導因子［3］。取50μL血淋巴細胞樣品加入到96孔板中，分別加入50μL CAC緩沖液混合均勻;25℃孵育10min;加入100μL L-多巴胺(3mg/mL溶于CAC緩沖液中)，混合均勻后置于酶標儀中，讀取490nm處吸光度值。酶活性的定義為在實驗條件下，每分鐘吸光度值增加0.001為1個酶活力單位。活性表示方法:每毫克蛋白所具有的酶活力。

CAC 緩沖液配方:0.01mol/L 二甲基胂酸鈉，0.45mol/L NaCl，10mmol/L CaCl2·6H2O，26mmol/L MgCl2·2H2O，調 pH 7.0。

1.9 亮氨酸氨基肽酶(LAP)活性

LAP活性測定采用Oubella等人［4］的方法，向96孔酶標板各加入100μL血淋巴細胞樣品，再分別加入75 μL Tris-HCl(0.2 mol/L，pH 8.0)，混合均勻后分別加入25μL 10 mmol/L L-亮氨酸-4-硝基苯胺(去離子水配制，Sigma)，立即放于酶標儀上，記錄20min內(nèi)吸光度的變化情況(OD405nm，每5min讀數(shù)1次)。酶活性以每毫克蛋白濃度改變的吸光度值0.001為一個酶活力單位。活性表示方法:每毫克蛋白所具有的酶活力。

1.10 溶菌酶活性測定

溶菌酶測定采用Allam和Paillard［5］改進后的方法，以雞溶菌酶標準品為標準，取40μL標準品(濃度分別為0.6、1.25、2.5、5、10、20、40 mg/mL)或者血淋巴細胞樣品加入96孔酶標板中;分別向各孔中加入160μL容壁微球菌溶液(細菌OD600=0.4，緩沖液為0.06mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.4);室溫孵育1h，540nm讀取吸光度值，采用標準曲線計算血淋巴細胞溶菌酶活性?；钚员硎痉椒?每毫克蛋白所具有的酶活力。

1.11 總谷胱甘肽(GSH+GSSG)的測定

總谷胱甘肽的測定采用碧云天公司的GSH和GSSG檢測試劑盒進行，按照試劑盒說明書進行操作。

1.12 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

血淋巴超氧化物酶活性的測定采用碧云天生物技術研究所的總SOD活性檢測試劑盒進行測定，按照試劑盒說明書進行操作?；钚员硎痉椒?每毫克蛋白所具有的酶活力。

1.13 脂質氧化(MDA)的測定

脂質氧化的測定采用碧云天公司的脂質氧化檢測試劑盒進行，按照說明書進行相關操作。

1.14 總蛋白濃度的測定

血淋巴中總蛋白濃度的測定采用碧云天生物技術研究所Bradford蛋白濃度測定試劑盒進行測定，按照試劑盒說明進行操作。

1.15 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)使用spss11.5軟件分析，結果用平均值±標準差(means±SD)表 示，均采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 不同海區(qū)蛤仔個體肥滿度指數(shù)比較

不同海區(qū)蛤仔個體肥滿度指數(shù)依次為:皮口(1.47±0.06)＞黑石礁(1.05±0.08)＞莊河(0.87±0.05)＞登沙河(0.79±0.03)，但是各海區(qū)之間沒有顯著差異(P＜0.05)。

2.2 不同海區(qū)蛤仔血細胞總數(shù)比較

不同海區(qū)蛤仔血細胞總數(shù)的測定結果見圖2。皮口海區(qū)蛤仔血細胞總數(shù)最高，顯著高于莊河和黑石礁海區(qū)(P＜0.05);登沙河海區(qū)蛤仔血細胞總數(shù)居中，莊河和黑石礁海區(qū)蛤仔血細胞總數(shù)最低，但這3個海區(qū)無顯著差異。

2.3 不同海區(qū)蛤仔血細胞膜穩(wěn)定性比較

不同海區(qū)蛤仔血細胞膜穩(wěn)定性(ΔOD550/mg蛋白質)依次為:登沙河(0.135±0.041)＞莊河(0.127±0.026)＞皮口(0.091±0.017)＞黑石礁(0.090±0.004)，但各海區(qū)蛤仔血細胞膜穩(wěn)定性沒有顯著差異(P＜0.05)。

圖2 不同海區(qū)蛤仔血細胞總數(shù)比較Fig．2 Comparison of the THC of clam collected from different sea areas

2.4 不同海區(qū)蛤仔血細胞吞噬活性比較

不同海區(qū)蛤仔血細胞吞噬活性(×108mg-1蛋白質)依次為:登沙河海區(qū)(7.88±2.38)＞皮口海區(qū)(7.42±2.11)＞莊河(5.97±1.11)＞黑石礁(5.62±0.92)，但各海區(qū)蛤仔血細胞吞噬活性無顯著差異(P＜0.05)。

2.5 不同海區(qū)蛤仔血淋巴酚氧化酶活性比較

不同海區(qū)蛤仔血淋巴酚氧化酶活性 (U/mg蛋白質)依次為:莊河(277.1±60.3)＞登沙河(227.6±58.8)＞皮口(217.4±39.9)＞黑石礁(184.4±14.8)，但各海區(qū)蛤仔血淋巴酚氧化酶活性無顯著差異(P＜0.05)。

2.6 不同海區(qū)蛤仔血淋巴亮氨酸氨基肽酶活性比較

不同海區(qū)蛤仔血淋巴亮氨酸氨基肽酶活性測定結果如圖3。皮口海區(qū)蛤仔血淋巴LAP活性顯著高于其他3個海區(qū)(P＜0.05);登沙河、皮口和黑石礁海區(qū)蛤仔血淋巴LAP活性無顯著差異。

2.7 不同海區(qū)蛤仔血淋巴溶菌酶活性比較

不同海區(qū)蛤仔血淋巴溶菌酶活性測定結果見圖4。皮口海區(qū)蛤仔溶菌酶活性顯著高于其他3個海區(qū)(P＜0.05);登沙河、莊河和黑石礁海區(qū)蛤仔血淋巴溶菌酶活性無顯著差異。

圖3 不同海區(qū)蛤仔血淋巴LAP活性比較Fig．3 Comparison of the LAP activity of haemolymph in clams collected from different sea areas

圖4 不同海區(qū)蛤仔血淋巴溶菌酶活性比較Fig．4 Comparison of the LYZ activity of haemolymph in clams collected from different sea areas

2.8 不同海區(qū)蛤仔血淋巴總谷胱甘肽含量比較

不同海區(qū)蛤仔血淋巴總谷胱甘肽含量測定結果如圖5。黑石礁海區(qū)蛤仔血淋巴谷胱甘肽含量顯著高于其他3個海區(qū)(P＜0.05);登沙河、皮口和莊河海區(qū)血淋巴谷胱甘肽含量無顯著差異。

2.9 不同海區(qū)蛤仔血淋巴超氧化物歧化酶(SOD)活性比較

不同海區(qū)蛤仔血淋巴SOD活性測定結果見圖6。莊河海區(qū)蛤仔血淋巴SOD活性最高，登沙河海區(qū)蛤仔最低，二者差異顯著(P＜0.05);皮口和黑石礁海區(qū)蛤仔血淋巴SOD活性居中，與其他兩個海區(qū)蛤仔差異不顯著。

2.10 不同海區(qū)蛤仔血淋巴細胞脂質氧化比較

不同海區(qū)蛤仔血淋巴細胞脂質氧化測定結果見圖7。登沙河海區(qū)蛤仔血淋巴細胞脂質氧化最高，皮口海區(qū)蛤仔最低，二者差異顯著(P＜0.05);莊河和黑石礁海區(qū)蛤仔居中，與其他兩個海區(qū)相比無顯著差異。

圖5 不同海區(qū)蛤仔血淋巴總谷胱甘肽含量比較Fig．5 Comparison of the glutathione content of haemolymph in clams collected from different sea areas

圖6 不同海區(qū)蛤仔血淋巴SOD活性比較Fig．6 Comparison of the SOD activity of haemolymph in clams collected from different sea areas

圖7 不同海區(qū)蛤仔血淋巴脂質氧化比較Fig．7 Comparison of the lipid peroxidation level of haemolymph in clams collected from different sea areas

3 討論

貝類的免疫機制主要包括細胞免疫和體液免疫兩條途徑，其中血細胞是貝類執(zhí)行細胞免疫功能的最重要的細胞，是無脊椎動物免疫系統(tǒng)的第一道防線，環(huán)境因子的變化會對血細胞的免疫能力造成重要影響［6］。對牡蠣和蛤仔等貝類的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境污染物如石油烴和重金屬等長期脅迫能夠引起其體內(nèi)血細胞數(shù)量減少，原因可能是污染物引起貝類體內(nèi)含溶酶體豐富的血細胞溶解所致［7-9］。在本研究中，皮口海區(qū)蛤仔的血細胞總數(shù)最多，而黑石礁和莊河海區(qū)蛤仔血細胞數(shù)量最少，從表1可以發(fā)現(xiàn)，黑石礁和莊河海區(qū)蛤仔體內(nèi)的Cu等重金屬含量均比皮口和登沙河海區(qū)高，因此這兩個海區(qū)血細胞數(shù)量的減少可能是重金屬長期脅迫的結果。不過一些研究也發(fā)現(xiàn):短時間的污染物刺激可以導致貝類血細胞數(shù)量增加［10-15］，對于這些貝類短期內(nèi)血細胞數(shù)量增加的原因，有研究者認為是由于污染物的刺激導致組織血細胞轉移進入循環(huán)系統(tǒng)所致，也有學者認為是動物機體對污染物引起的血細胞膜穩(wěn)定性降低的一種補償機制［11-13］。因此，環(huán)境污染物導致貝類血細胞數(shù)量增加還是減少與暴露的時間以及污染物濃度有關［13］。

通常情況下，短期或者低濃度的污染物如工業(yè)廢水、農(nóng)藥、重金屬刺激被認為具有免疫刺激作用，能夠使貝類血細胞的吞噬活性增強［14-16］。而高濃度污染物或者污染物長期脅迫能夠抑制貝類細胞的吞噬能力，原因主要是由于脂溶性污染物如PHA等以及重金屬能夠與細胞膜結合，改變細胞膜的流動性和細胞膜上離子泵，導致細胞膜穩(wěn)定性降低，并且能夠阻礙血細胞變形運動，降低其吞噬活性［17-18］。本研究中四個海區(qū)蛤仔的細胞膜穩(wěn)定性和吞噬能力并沒有顯著地差異，原因可能是海區(qū)中的污染物濃度尚未達到對膜穩(wěn)定性和吞噬能力產(chǎn)生顯著影響的閾值［19］，亦可能是貝類細胞對污染物刺激產(chǎn)生適應性的結果［20］。

當貝類損傷或者受到病原微生物感染時，能夠激活體內(nèi)酚氧化酶原(PPO)生成酚氧化酶(PO)，將體內(nèi)的苯酚氧化成苯醌并最終生成黑色素參與動物的免疫反應［21］。多種環(huán)境污染物能夠通過改變貝類血細胞PO的活性而影響其免疫能力，Tujula等發(fā)現(xiàn)使用含有機錫(TBT)和Cu的培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后，海鞘(Styela plicata)血細胞酚氧化酶活性顯著降低［22］;Bado-Nilles等人研究證實受到石油污染14d后，牡蠣(Crassostrea gigas)血細胞酚氧化酶活性受到抑制［23］;Gagnaire等用Hg處理牡蠣血細胞21h后，其酚氧化酶活性降低［24］。不過研究發(fā)現(xiàn)使用氯化鎘(CdCl2)或者Zn離子處理的鮑魚血細胞，其酚氧化酶活性卻顯著升高［25-26］，因此環(huán)境污染物對酚氧化酶活性的影響可能與動物及污染物的種類有關［25］。在本研究中，各海區(qū)蛤仔血細胞的酚氧化酶活性并未表現(xiàn)出顯著差異，其原因可能是蛤仔對污染物長期刺激產(chǎn)生適應性的結果。

貝類血細胞溶酶體中含有各種水解酶包括溶菌酶、氨肽酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶等，當外來異物進入體內(nèi)或環(huán)境發(fā)生變化時，這些水解酶可以通過胞內(nèi)和胞外途徑，參與對異物以及病原的殺傷與清除。對牡蠣(Crassostrea gigas)和濱螺(Littorina littorea)等貝類的調查和研究發(fā)現(xiàn):海水中的有機污染物和重金屬等能夠導致貝類血淋巴溶菌酶活性降低，并且這種活性的降低與血細胞總數(shù)之間存在相關性［13，27-28］。污染物可能通過以下兩條途徑導致細胞體內(nèi)水解酶活性降低:一是由于污染物造成的血細胞溶解導致;另一個可能的原因是污染物改變貝類血細胞內(nèi)溶酶體膜通透性，一些水解酶滲漏所致［29］。在本研究中，登沙河、莊河和黑石礁海區(qū)蛤仔血細胞的亮氨酸氨基肽酶和溶菌酶活性顯著低于皮口海區(qū)，與這3個海區(qū)環(huán)境中較高的污染物濃度可能有直接的關系。

研究證實，當受到環(huán)境脅迫時，貝類能夠通過呼吸爆發(fā)作用產(chǎn)生大量活性氧，幫助機體清除進入體內(nèi)的病原，但過量的活性氧會導致動物體內(nèi)細胞膜的脂質氧化程度增加，因此貝類體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)會被激活，避免活性氧對細胞造成損傷［28，30-32］。在本研究中，登沙河海區(qū)的蛤仔血細胞谷胱甘肽含量在4個海區(qū)中處于較低水平，并且其SOD活性最低，表明其抗氧化能力受到抑制，因此其細胞膜的脂質氧化程度最大，這一結論與上述研究的結果相一致。但人們也發(fā)現(xiàn):黑石礁海區(qū)蛤仔血細胞谷胱甘肽含量最高，而莊河海區(qū)的蛤仔血細胞具有最高的SOD活性，但是這兩個海區(qū)蛤仔的血細胞脂質氧化水平仍然處于較高水平。觀察這兩個海區(qū)蛤仔體內(nèi)的污染物檢測結果(表1)發(fā)現(xiàn):其體內(nèi)重金屬含量遠高于其他兩個海區(qū)的蛤仔，并且黑石礁海區(qū)蛤仔體內(nèi)的石油污染物水平在4個海區(qū)中也處于較高水平。谷胱甘肽除作為一種重要的細胞抗氧化成分，其本身也是體內(nèi)一些催化解毒和污染物代謝反應的酶作用后的產(chǎn)物［33］，因此這兩個海區(qū)蛤仔血細胞較高的谷胱甘肽水平可能是個體對長時間較高濃度污染物刺激的一種保護性反應。此外有研究證實長期的污染物刺激能夠導致貽貝(Mytilus edulis)體內(nèi)活性氧如H2O2和NO等含量增加，推測可能是對其血細胞吞噬能力降低的一種補償機制［34］，因此黑石礁和莊河海區(qū)蛤仔血淋巴較高的SOD水平可能與其血細胞較低的吞噬活性有關。

綜上所述，養(yǎng)殖水環(huán)境中的重金屬和石油等有機污染物脅迫能誘導蛤仔產(chǎn)生免疫抑制并導致其抗病能力的降低，加之夏季高溫環(huán)境細菌大量繁殖是導致蛤仔大規(guī)模死亡的重要誘因。因此，減少養(yǎng)殖海區(qū)環(huán)境污染，凈化養(yǎng)殖環(huán)境，是防止蛤仔疾病爆發(fā)的有效途徑。

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