李里，宮亮，吳玉斌

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒腎內(nèi)科，沈陽 110004；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院兒科，遼寧 錦州 121000；3.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，遼寧 錦州 121000）

配對盒基因 2（paired box gene 2，PAX2）編碼核轉(zhuǎn)錄因子，參與胚胎腎臟各個(gè)發(fā)育階段的調(diào)控，成熟腎單位其表達(dá)消失，病理腎臟出現(xiàn)重新表達(dá)［1，2］。PAX2被認(rèn)為是腎纖維化的危險(xiǎn)因素。部分研究認(rèn)為PAX2通過調(diào)控細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腎纖維化［3］。后腎發(fā)育過程中PAX2是間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)分化必需的［4］，故Huang等［5］認(rèn)為腎小管上皮細(xì)胞PAX2重新表達(dá)可能是啟動(dòng)了上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）過程，沉默 PAX2 可以逆轉(zhuǎn)腎纖維化。本課題組研究認(rèn)為PAX2可能通過EMT導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化以及腎功能進(jìn)行性衰竭［6］。前期研究結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2后正常腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)EMT［7］。PAX2通過何種通路誘導(dǎo)EMT尚不清楚。目前研究發(fā)現(xiàn)PAX2可能參與的通路有 Ret/Gdnf通路［8］、Hox11-Eya1-PAX2 通路［9］等。在胚胎內(nèi)PAX2通過激活WNT4通路誘導(dǎo)后腎發(fā)育，WNT4通路又是EMT重要通路。故我們推測PAX2通過激活WNT4通路誘導(dǎo)EMT。本實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用WNT通路拮抗劑阻斷WNT4通路，觀察是否可使穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2細(xì)胞出現(xiàn)的EMT出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。目前尚沒有針對WNT4通路的特異阻斷劑，故在本實(shí)驗(yàn)中我們選擇WNT通路拮抗劑WNT抑制因子 1（Wnt inhibitory factor-1，WIF-1），其屬于WNT拮抗物家族，通過直接與WNT蛋白相連從而阻止WNT與受體蛋白復(fù)合物相連，使細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin由于磷酸化而不能積累，進(jìn)而阻斷了WNT經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路。本實(shí)驗(yàn)觀察是否可使穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2誘導(dǎo)的EMT的腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化逆轉(zhuǎn)，探討WNT通路在PAX2誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

正常大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK52E購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，pEGFP-PAX2質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)前期合成。主要試劑：脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、胰蛋白酶、G418（美國Gibco公司）；質(zhì)粒大量制備試劑盒（北京 BioTeke公司）；WNT4、β-catenin、E 鈣黏蛋白（E-cadherin）、α-肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）及β-actin單抗（美國Santa Cruz公司）；DNA Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；WIF-1（美國R&D Systems）。

1.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2腎小管上皮細(xì)胞的建立及分組

應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組質(zhì)粒pEGFP-PAX2轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組：轉(zhuǎn)染組、空載組及對照組。細(xì)胞株貼壁培養(yǎng)含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長。每2～3 d用0.25%胰酶（內(nèi)含0.02%EDTA）消化傳代。

將WIF-1加入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2腎小管上皮細(xì)胞，細(xì)胞共分為4組：WIF-1 5 μg/mL組、WIF-1 10 μg/mL組、WIF-1 15 μg/mL組和穩(wěn)轉(zhuǎn)組。處理48 h后收集細(xì)胞。

1.3 實(shí)時(shí)PCR

收集各組細(xì)胞（2×106個(gè)），采用 Trizol試劑，按說明書進(jìn)行操作。用紫外分光光度計(jì)測260 nm/280 nm的吸光度比值及樣本濃度，檢測提取的RNA產(chǎn)量及質(zhì)量。RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系經(jīng)37℃15 min、85℃5 s反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板分別用WNT4、β-catenin、E-cadherin及 α-SMA 引物經(jīng) PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。采用ABI7500熒光定量PCR儀，SYBR Green熒光染料摻入法相對定量，以內(nèi)參照為對照，計(jì)算差異表達(dá)的倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列如下：WNT4：正義鏈，5′-TTCGGGAAGGTGGTGA CACAAG-3′；反義鏈，5′-ACAGTGAGAAGGCTACGC CATAGG-3′，211 bp。β-catenin：正義鏈，5′-AGCGAC TAAGCAGGAAGGGAT-3′；反義鏈，5′-ACAGATGGC AGGCTCGGTAAT-3′，226 bp。E-cadherin：正義鏈，5′-AAAGCAGGAAGAAAACACCACTC-3′；反義鏈，5′-AAAGGGCACGCTATCAACATTAG-3′，172bp。α-SMA：正義鏈，5′-CTCATCCACGAAACCACCTAT-3′；反義鏈，5′-CGCCGATCCAGACAGAATA-3′，211bp。β-actin：正義鏈，5′-ACGTTGACATCCGTAAAGAC-3′；反義鏈，5′-GAAGGTGGACAGTGAGGC-3′，200 bp。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；最后72℃5 min。

1.4 Western blot

收集各組細(xì)胞（2×106個(gè)），裂解后提取總蛋白，檢測轉(zhuǎn)染組、空載組及對照組WNT4和β-catenin蛋白含量，檢測加藥后各組β-catenin、E-cadherin和α-SMA蛋白。操作按試劑盒說明書進(jìn)行，每孔上樣50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜1 h，轉(zhuǎn)膜后5%牛奶封閉2 h，Ⅰ抗孵育4℃過夜，1%TBST洗3次，每次10 min，Ⅱ抗孵育1 h，再0.1%TBST洗3次，每次10 min，ECL曝光，蛋白的表達(dá)量由Band－Scan圖像分析系統(tǒng)根據(jù)相應(yīng)電泳條帶亮度計(jì)算，用β-actin作內(nèi)參照驗(yàn)證蛋白的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞免疫熒光

將 WIF-1 10 μg/mL 組、WIF-1 15 μg/mL 組和穩(wěn)轉(zhuǎn)組做細(xì)胞爬片，甲醇固定15 min，3%BSA封閉30 min，Ⅰ抗（1∶50）4℃孵育過夜，PBS洗 3次，每次 10 min，Ⅱ抗（1∶100）避光孵育 1 h，PBS 洗 3 次，每次10 min，DAPI復(fù)染10 min，封片，激光共聚焦顯微鏡下拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

WNT4、β-catenin、E-cadherin 及 α-SMA 表達(dá)水平以±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組組間比較采用Student′st檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAX2基因轉(zhuǎn)染激活WNT4/β-catenin通路

通過檢測WNT4和β-catenin的表達(dá)水平來判斷PAX2基因是否激活WNT4/β-catenin。Western blot和實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染組WNT4和β-catenin蛋白和mRNA表達(dá)水平較空載組及對照組明顯增加（P ＜ 0.05），見圖 1、表 1。

2.2 應(yīng)用WIF-1阻斷WNT4通路后WNT通路分子β-catenin和α-SMA下調(diào)、E-cadherin上調(diào)

Western blot和實(shí)時(shí)PCR結(jié)果表明，WIF-1 5 μg/mL 組、WIF-1 10 μg/mL 組及 WIF-1 15 μg/mL 組中β-catenin、α-SMA蛋白和mRNA表達(dá)較穩(wěn)轉(zhuǎn)組下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），WIF-1 15 μg/mL組下降明顯。各濃度組細(xì)胞中E-cadherin蛋白和mRNA較穩(wěn)轉(zhuǎn)組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），WIF-1 15 μg/mL 組明顯，見圖 2、表 2。

免疫熒光結(jié)果：WIF-1 10 μg/mL組和 WIF-1 15g/mL組細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中β-catenin蛋白表達(dá)較穩(wěn)轉(zhuǎn)組減少，為綠色熒光分布，其中WIF-1 15 μg/mL 組減少明顯。WIF-1 10 μg/mL 組和 WIF-1 15 μg/mL組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)較穩(wěn)轉(zhuǎn)組增加，呈綠色線性在細(xì)胞膜分布，其中WIF-1 15 μg/mL組增加明顯。WIF-1 10 μg/mL組和WIF-1 15 μg/mL組細(xì)胞中α-SMA蛋白表達(dá)較穩(wěn)轉(zhuǎn)組減少，在細(xì)胞質(zhì)呈綠色絲狀分布，其中WIF-1 15 μg/mL組減少明顯，核藍(lán)色為DAPI染色，見圖3。

表2 WIF-1阻斷WNT通路對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞β-catenin、E-cadherin和α-SMA蛋白和mRNA表達(dá)的影響Tab.2 Effects of WIF-1 blocking WNT4 pathway on β-catenin，E-cadherin and α-SMA protein and mRNA expression in PAX2 transfected cells

3 討論

WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條在生物進(jìn)化中極為保守的通路，調(diào)控機(jī)體的許多生命過程。目前比較清楚的是WNT/β-catenin通路，即經(jīng)典通路。β-catenin是其下游關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)分子。對于WNT4，雖然傳統(tǒng)上將其劃分為激活非經(jīng)典WNT信號(hào)通路的WNT配體分子，但最近的研究表明，WNT4實(shí)際上可以通過與受體結(jié)合進(jìn)而激活經(jīng)典的WNT/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞調(diào)控作用。WNT/β-catenin是目前研究細(xì)胞EMT調(diào)控機(jī)制中三條主要通路之一［10］。有研究表明該通路參與了肺、肝臟等器官纖維化過程［11，12］，同時(shí)在單側(cè)輸尿管梗阻所致慢性腎間質(zhì)纖維化大鼠模型中，也發(fā)現(xiàn)WNT/β-catenin信號(hào)途徑被激活，包括WNT4在內(nèi)的多種WNT蛋白參與了腎小管間質(zhì)纖維化過程，并誘導(dǎo)促進(jìn)纖維化的靶基因表達(dá)。分析其促纖維化機(jī)制，認(rèn)為該通路可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞出現(xiàn)EMT改變，促使細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致纖維化［13］。

目前利用阻斷劑抑制WNT配體分子與其受體結(jié)合，間接下調(diào)β-catenin的表達(dá)水平，是探討WNT/β-catenin功能的常用方法。WIF-1是WNT信號(hào)通路上的拮抗物之一，可以阻斷WNT的經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路。WIF-1、sFRP和CER屬于WNT拮抗物家族，通過直接與WNT蛋白結(jié)合從而阻止WNT與受體蛋白復(fù)合物相連，使細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin由于磷酸化而不能積累，進(jìn)而阻斷了WNT通路。

前期工作中我們觀察到PAX2能誘導(dǎo)正常腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)EMT。在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到PAX2轉(zhuǎn)染后激活了WNT信號(hào)通路中的WNT4通路，最終上調(diào)β-catenin表達(dá)水平。之后我們應(yīng)用不同濃度WIF-1作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2細(xì)胞，檢測其對β-catenin蛋白及mRNA表達(dá)水平的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：WIF-1 5 μg/mL 組、WIF-1 10 μg/mL 組及WIF-1 15 μg/mL組細(xì)胞中β-catenin蛋白及mRNA表達(dá)較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2細(xì)胞組減少，呈濃度依賴性，其中WIF-1 15 μg/mL組下降明顯。表明WIF-1可以下調(diào)β-catenin的表達(dá)，進(jìn)而阻斷了WNT通路。

我們對應(yīng)用WIF-1處理后的各組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)分化表型標(biāo)志物E-cadherin和α-SMA的檢測，觀察阻斷WNT通路后是否會(huì)導(dǎo)致PAX2誘導(dǎo)的EMT出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用WIF-1阻斷后各個(gè)濃度組上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物E-cadherin在蛋白和基因水平的表達(dá)隨WIF-1濃度的增加而逐漸增加，以WIF-1 15 μg/mL組增加明顯。而成纖維細(xì)胞表型標(biāo)志物α-SMA在蛋白和基因水平隨WIF-1濃度的增加而逐漸減少，以WIF-1 15 μg/mL組減少明顯。這提示應(yīng)用WIF-1阻斷后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2的EMT的腎小管上皮出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化逆轉(zhuǎn)。

綜上，我們將PAX2基因轉(zhuǎn)染正常腎小管上皮細(xì)胞，在體外誘導(dǎo)了正常腎小管上皮細(xì)胞激活了WNT4及β-catenin的表達(dá)，阻斷WNT通路后出現(xiàn)了轉(zhuǎn)分化逆轉(zhuǎn)。

［1］Davis JL，Matsumura L，Weeks DA，et al.PAX2 expression in Wilms tumors and other childhood neoplasms［J］.Am J Surg Pathol，2011，35（8）：1186-1194.

［2］Hill GS，Karoui KE，Karras A，et al.Focal segmental glomerulosclerosis plays a major role in the progression of IgA nephropathy［J］.Kidney Int，2011，79（6）：635-642.

［3］Cohen T，Loutochin O，Amin M，et al.PAX2 is reactivated in urinary tract obstruction and partially protects collecting duct cells from programmed cell death［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2007，292（4）：F1267-F1273.

［4］Rothenpieler UW，Dressler GR.Pax-2 is required for mesenchymetoepithelium conversion during kidney development［J］.Development，1993，119（3）：711-720.

［5］Huang B，Pi L，Chen C，et al.WT1 and Pax2 re-expression is required for epithelial-mesenchymal transition in 5/6 nephrectomized rats and cultured kidney tubular epithelial cells［J］.Cells Tissues Organs，2012，195（4）：296-312.

［6］Li L，Wu YB，Zhang WG.PAX2 re-expression in renal tubular epithelial cells and correlation with renal interstitial fibrosis of rats with obstructive nephropathy［J］.Ren Fail，2010，32（5）：603-611.

［7］Li L，Wu Y，Yang Y.Paired box 2 induces epithelial-mesenchymal transition in normal renal tubular epithelial cells of rats［J］.Mol Med Rep，2013，7（5）：1549-1554.

［8］Clarke JC，Patel SR，Raymond RM，et al.Regulation of c-Ret in the developing kidney is responsive to Pax2 gene dosage［J］.Hum Mol Genet，2006，15（23）：3420-3428.

［9］Gong KQ，Yallowitz AR，Sun H，et al.A Hox-Eya-Pax complex regulates early kidney developmental gene expression［J］.Mol Cell Biol，2007，27（21）：7661-7668.

［10］Liu YH.New insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21（2）：212-222.

［11］Chilosi M，Poletti V，Zamo A，et al.Aberrant Wnt/beta-catenin pathway activation in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Am J Pathol，2003，162（5）：1495-1502.

［12］Jiang F，Parsons CJ，Stefanovic B.Gene expression profile of quiescent and activated rat hepatic stellate cells implicates Wnt signaling pathway in activation［J］.J Hepatol，2006，45（3）：401-409.

［13］He W，Dai C，Li Y，et al.Wnt/beta-catenin signaling promotes renal interstitial fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2009，20（4）：765-776.