張艷，張蕊，王玥，郭艷峰，李艷

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，沈陽 110001）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為20～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，主要通過與靶基因mRNA的3′UTR上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平（RNA切割或翻譯抑制）負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)，抑制其翻譯或使mRNA發(fā)生降解［1］。miRNA在造血鏈系分化中發(fā)揮重要作用，并且還被證實(shí)與白血病密切相關(guān)，起癌基因和抑癌基因的雙重作用［2］。miR-126是內(nèi)皮細(xì)胞特異性miRNA，能夠通過靶基因介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的反應(yīng)，在血管生成過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)與急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）細(xì)胞形態(tài)分型相關(guān)［3，4］，各類核型異常 AML 的 miRNA表達(dá)也具有不同特點(diǎn)［5］。但目前關(guān)于miR126在AML中表達(dá)情況的研究甚少。本研究應(yīng)用RT-PCR檢測了miR126在AML患者中的表達(dá)情況，旨在揭示miR126在AML中的表達(dá)特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2012年2月至2013年2月在我院診斷為AML的初診患者骨髓標(biāo)本47例。男22例，女25例，年齡21～88歲，F(xiàn)AB分型：M1型1例，M2型11例，M3型12例，M4型2例，M5型19例，M6型 1例，AML未分型1例。對照組9例，男7例，女2例，年齡21～58歲，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查提示為：繼發(fā)性貧血、缺鐵性貧血及未見特征性血液病改變。所有患者經(jīng)過骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫分型、分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)等檢查確診。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第3版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2 TagMan RT-PCR

miRNA提取、探針、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR擴(kuò)增酶均購自ABI公司（Applied Biosystems）。miRNA的提取按試劑盒說明書進(jìn)行，測定其濃度及OD260/280為1.8～2.0者用于實(shí)時(shí)PCR檢測，濃度調(diào)整至1.0ng/μL。按TagMan MicroRNA Assays說明書操作，選擇U6作為內(nèi)參對照，引物序列如下：miR-126：5′UCGUAC CGUGAGUAAUAAUGCG3′；U6：5′CGCTTCACGAAT TTGCGTGTCAT3′。逆轉(zhuǎn)錄體系為：dNTP 0.15 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶 1.0 μL，10 × RT Buffer 1.5 μL，RNA 酶抑制劑 0.19 μL，水 4.16 μL，RT-miR126/RT-U6 探針 3.0 μL，RNA 5.0 μL，總體系 15 μL。反應(yīng)條件為：16 ℃30 min；42℃ 30 min；85℃ 5 min；4℃保持；反應(yīng)產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩０串a(chǎn)品說明書，PCR擴(kuò)增總體系為 20 μL：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1.33 μL，TaqMan 擴(kuò)增酶10 μL，水 7.67 μL，TaqMan miRNA Assay1.0 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min；95℃ 10 min，95℃ 15 s，60 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)CT值，計(jì)算miR126表達(dá)量。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用相對定量法分別分析AML患者和對照組miR126相對表達(dá)水平的差異。以U6為內(nèi)參照，利用Ct值計(jì)算各組表達(dá)的相對量。△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)樣本-△Ct校準(zhǔn)樣本，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，基因表達(dá)差異的倍數(shù)即為相對定量2-△△Ct。結(jié)果采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性研究應(yīng)用直線相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR126在AML患者及正常人中的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：47例初發(fā)未治AML患者骨髓中miR126相對表達(dá)水平（0.922±1.660）較對照組（0.511±0.398）增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 miR126在AML亞型中表達(dá)的差異

47例AML患者中miR126相對表達(dá)水平M3型（0.277±0.138）低于非 M3型（1.143±1.878），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.3 miR126表達(dá)與AML患者基因型表達(dá)的相關(guān)分析

47例AML患者中，進(jìn)行染色體核型分析或融合基因檢測者35例，其中27例有異常表達(dá)，8例為正常表達(dá)。正?；蛐蚼iR126表達(dá)水平（1.347±2.165）與異?；蛐停?.866±1.807）比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；伴有t（15；17）或PML/RaRa異常的10例AML患者miR126表達(dá)水平（0.278±0.152）低于其他基因型的25例AML患者（1.255±2.193），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2.4 miR126與臨床相關(guān)性

AML患者中miR126表達(dá)水平與初診時(shí)骨髓原始細(xì)胞百分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.352，P=0.018），與初診時(shí)外周血白細(xì)胞數(shù)、年齡及性別均無相關(guān)性（r=0.04，P=0.79；r=-0.238，P=0.108；r=-0.229，P=0.121）。

3 討論

白血病是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其中AML約占59%。miRNA是一類內(nèi)源性的長約20～25個(gè)核苷酸的非蛋白編碼的單鏈RNA分子，通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及腫瘤等疾病的調(diào)節(jié)，并在多種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮功能以調(diào)節(jié)白血病等血液系統(tǒng)疾病的形成。自從2007年關(guān)于AML中miRNA的表達(dá)譜報(bào)道以來［6］，全球已掀起了廣泛的miRNA在急性白血病中的研究熱潮。其調(diào)控機(jī)制主要為經(jīng)過剪切修飾的成熟miRNA并入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，通過結(jié)合靶mRNA的3＇-UTR端非翻譯區(qū)抑制靶mRNA表達(dá)，通過抑制翻譯或降解靶mRNA的機(jī)制來實(shí)現(xiàn)相關(guān)調(diào)節(jié)［7］。近年來的研究表明，miRNA在不同基因型的AML中表達(dá)存在差異，某些miRNA的表達(dá)情況與AML的預(yù)后相關(guān)，發(fā)揮癌基因和抑癌基因的雙重作用［2］。

miR126位于9q34.3，是內(nèi)皮細(xì)胞特異性miRNA，能夠通過靶基因介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的反應(yīng)，在血管生成過程中發(fā)揮重要作用。Li等［8］研究發(fā)現(xiàn)miR-126在伴有t（8；21）、inv（16）或t（16；16）的AML患者中表達(dá)增高，而伴有t（15；17）的AML患者中表達(dá)減低，原因是其啟動(dòng)子區(qū)去甲基化所致，與該基因位點(diǎn)的擴(kuò)增或突變無關(guān)，并發(fā)現(xiàn)伴有這些特殊核型改變的miR-126升高的AML細(xì)胞中其靶基因SPRED1表達(dá)降低，與miR-126介導(dǎo)的血管和淋巴血管新生相關(guān)［9］。目前國內(nèi)外對于miR126在AML臨床樣本中表達(dá)情況的研究甚少，二者的相關(guān)性有待于進(jìn)一步的揭示。

本研究對47例初發(fā)成人AML患者及9例正常人miR126表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：AML患者miR126總體表達(dá)高于正常人，但差別無顯著性，考慮與樣本數(shù)受限有關(guān)，或在AML中miR126的表達(dá)情況在各亞型中存在差異所致；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，各亞型中M3型miR126表達(dá)低于非M3型（P<0.05）；正常基因型與異?；蛐偷谋磉_(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但伴有 t（15；17）或 PML/RaRa 陽性的 10 例AML患者miR126表達(dá)低于其他基因型的25例AML 患者（P<0.05），而 Li等［8］的研究中伴有 t（15；17）的AML患者miR126表達(dá)減低，伴有此類基因型異常的患者常為M3型，本研究結(jié)果與其研究結(jié)果相似，提示miR126可用于區(qū)分AML亞型。本研究還發(fā)現(xiàn)AML患者中miR126表達(dá)水平具有與初診時(shí)骨髓原始細(xì)胞百分?jǐn)?shù)負(fù)相關(guān)的臨床特征，但仍有待于進(jìn)一步臨床大樣本的驗(yàn)證和研究。

本研究初步揭示了miR126表達(dá)與AML的相關(guān)性，在不同亞型、基因型中miR126的表達(dá)存在差異，然而產(chǎn)生差異的原因及機(jī)制仍需更深入的研究。

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