李婷婷，吳彩娥，方升佐，范龔健，應(yīng)瑞峰，吳海霞

(南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇南京210037)

據(jù)報道截止2010年，全球范圍內(nèi)有2.85億人受到糖尿病的影響，而預(yù)計到2030年糖尿病患者的人數(shù)將增加到4.39億［1］?？梢?，在糖尿病的形勢日趨嚴重的今天，探索具有糖尿病預(yù)防和治療作用的功能成分顯得尤為重要。目前口服降糖產(chǎn)品很多，但臨床治療用藥大多為西藥，其作用機制不同，主要包括促胰島素分泌，增加外圍組織對葡萄糖的利用和敏感性，抑制肝糖異生和α－葡萄糖苷酶活性等［2］，西藥所帶來的不良反應(yīng)較多［3］，因此，積極尋找能夠治療糖尿病的天然植物活性成分成為眾學(xué)者研究熱點［4］。青錢柳是我國獨有的單種屬植物，系雙子葉植物綱，胡桃科青錢柳屬［5］。作為我國特有的保健食品資源，自青錢柳的降血糖生理活性被發(fā)現(xiàn)以來［6－7］，青錢柳的功效作用逐漸被大眾所熟悉，市面上青錢柳的初級產(chǎn)品也逐漸增多，然而其精深加工產(chǎn)品以及產(chǎn)品的基礎(chǔ)功能學(xué)評價僅有較少的報道［8］，因此，其進一步深入加工應(yīng)用及產(chǎn)品的功效評判顯得尤為重要。硬膠囊具有可掩蓋內(nèi)容物不適氣味、美觀、易服、崩解快、溶出度高、吸收好、生物利用度高等優(yōu)點，是中藥和保健食品的常用劑型，但隨著硬膠囊劑的廣泛應(yīng)用，其裝量穩(wěn)定性成為影響硬膠囊質(zhì)量的主要因素之一［9］，也是產(chǎn)品開發(fā)過程中需要解決的問題之一。本實驗對青錢柳硬膠囊顆粒的裝量穩(wěn)定性進行了考察，并通過鏈佐霉素(STZ)誘導(dǎo)建立了小鼠糖尿病模型，由小鼠的多項生理生化指標變化評價了該硬膠囊的降糖功效，為青錢柳的這一新型藥用資源的深入研究開發(fā)提供實驗科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青錢柳膠囊 南京林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)實驗室研制提供;鏈佐霉素 美國Sigma公司產(chǎn)品;檸檬酸、甲醛、蒽酮、濃硫酸等藥品 南京化學(xué)有限公司，均為分析純;消渴丸 廣州中一藥業(yè)有限公司;SPF級ICR小鼠72只，每只體質(zhì)量18～22g南通大學(xué)實驗動物中心提供，分籠飼養(yǎng)，保持環(huán)境溫度20～25℃，濕度40～70%，飼以實驗動物用普通飼料，自由進食飲水。

ACCU－CHEK Advantage血糖檢測系統(tǒng) 羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;AU2700全自動生化分析儀日本Olympus公司;UVmini－1240型紫外分光光度儀 日本島津公司;Sigma 2－16K型冷凍離心機 德國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 青錢柳硬膠囊的制備 青錢柳硬膠囊是將青錢柳中的活性成分高效提取出來后，經(jīng)配方優(yōu)化篩選、制粒、填充等工序，由南京林業(yè)大學(xué)食品實驗室研制所得，其詳細制備工藝參照專利［10］《青錢柳膠囊及其制備方法》的內(nèi)容。

1.2.2 青錢柳硬膠囊的裝量穩(wěn)定性

1.2.2.1 硬膠囊顆粒含水量的測定 參照《中國藥典》(2010年版)一部附錄附錄Ⅸ.水分測定法［11］。取供試品2～5g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱瓶中，厚度不超過5mm，疏松供試品不超過10mm，精密稱定，打開瓶蓋在100～105℃干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30min，精密稱定重量，再在上述溫度干燥1h，冷卻稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5mg為止。

1.2.2.2 硬膠囊顆粒堆密度的測定 參照國標GB/T13566.1－2008［12］中疏松堆密度(ρ，單位為 g/cm3)的測定方法，具體操作即:取足夠量的硬膠囊粉末，從漏斗中垂直自由落入已知重量(m1，單位為g)和容積(V，單位為cm3)的無嘴量筒中，當(dāng)粉末溢出測量筒后，用刮板刮去多余的粉末，測量筒在填充時避免振動，小心地秤量滿載測量筒的重量(m2)，其堆密度ρ =(m2－m1)/V。

1.2.2.3 硬膠囊顆粒休止角的測定 采用固定漏斗法，參照國標 GB 11986－89［13］中休止角(α)的測定方法略有改動，具體操作為:將漏斗固定于水平放置的坐標紙上一定高度處(H)，小心地將硬膠囊粉末沿漏斗壁倒入漏斗中，直到坐標紙上形成的粉末圓錐體尖端接觸到漏斗口為止，由坐標紙測出圓錐底部的直徑(2R)，計算出休止角tgα=H/R。

1.2.2.4 裝量差異 參照中國藥典(2010年版)附錄I L.膠囊劑裝量差異［14］，取供試品10粒，分別精密稱定每粒重量后，打開囊帽，傾出內(nèi)容物(不得損失囊殼)，硬膠囊囊殼用小刷拭凈，分別精密稱定其重量，計算出每粒的凈重量，并求得平均值，各個膠囊凈重量與平均值之差占平均值的百分數(shù)，即為該粒膠囊的裝量差異值。

1.2.3 青錢柳硬膠囊的藥效學(xué)評價

1.2.3.1 STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型的建立及給藥方法 將72只ICR小鼠隨機分成6組，每組12只，除正常組外，其余各組小鼠尾部靜脈注射濃度為20mg/mL鏈佐霉素檸檬酸(0.05mol/L)溶液，注射劑量為10mL/kg，48h后取血檢測小鼠空腹血糖值。檢測血糖濃度在15～30mmol/L時表明STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型成功。(正常小鼠空腹血糖參考值:3.5～7.1mmol/L)。

將造模成功的高血糖小鼠，按照青錢柳膠囊高劑量組2g/kg，中劑量組1g/kg，低劑量組0.5g/kg，陽性對照組給于消渴丸2g/kg，將上述藥粉分別溶于純凈水中，各給藥組給予10mL/kg供試液，每天上午9點按每只動物的體質(zhì)量將藥液灌胃給藥1次，連續(xù)給藥21d。正常對照組和模型對照組給予等體積蒸餾水灌胃。實驗期間自由飲水，給予普通飼料。

1.2.3.2 實驗小鼠相關(guān)生理指標的檢測 血糖、體質(zhì)量的檢測:每給藥1周鼠尾靜脈采血一次測量空腹血糖、以血糖檢測儀測其血糖，并以電子天平稱其體質(zhì)量，按照新體質(zhì)量新計算給藥量。給藥期間觀測小鼠的形態(tài)變化，末次給藥后，測量體質(zhì)量、血糖值。

總膽固醇和甘油三酯的檢測:在末次灌胃后，分別眼眶后靜脈叢取血，取全血離心得血清，用全自動生化分析儀對小鼠的總膽固醇和甘油三酯進行檢測分析。

肝糖原含量的檢測:動物取血死亡后即刻解剖，取新鮮肝臟樣本用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱重。按照文獻方法［15］采用蒽酮硫酸法顯色測定小鼠肝糖原含量。

1.2.3.3 實驗小鼠胰腺組織的病理學(xué)檢查 將高、中、低劑量組、陽性對照組、正常組以及模型組小鼠的胰臟組織取出后，浸泡于10倍體積的10%甲醛溶液中固定48h，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，將其制成連續(xù)切片，蘇木素伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化并拍照。同時用顯微測微器在100倍鏡下觀察胰島的面積以及每視野的胰島數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以“平均值±標準誤”形式表示，組間比較采用t檢驗，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 青錢柳硬膠囊的裝量穩(wěn)定性

2.1.1 青錢柳硬膠囊內(nèi)容物的流動性和含水量 硬膠囊在填充時其裝量穩(wěn)定性受充填物料的流動性影響最大，物料流動性越好，膠囊填充的裝量穩(wěn)定性越易于控制?？疾靸?nèi)容物流動性好壞最直觀的指標有:內(nèi)容物的休止角、堆密度、粒度分布性及含水量等。不同制備工藝、配方生產(chǎn)出的膠囊內(nèi)容物其流動性不同，表現(xiàn)出的休止角和堆密度也不同，因此，本實驗通過測定上述指標可以評價該青錢柳膠囊的裝量穩(wěn)定性。休止角的大小反映出粉末顆粒之間的相對運動的自由程度，當(dāng)其越小時，表明物料流動性越好，膠囊填充的裝量穩(wěn)定性易于控制。一般認為［16］，休止角小于30°時，其流動性良好;而大于 40°時，流動性不好，當(dāng)休止角小于40°時可以直接充填。通過實驗測定本膠囊的休止角為30.1°，處于適宜的范圍內(nèi)，表明該硬膠囊的流動性較好。堆密度是物料單位容積的重量，在充填過程中若單位容積的重量較大，則流動性較好，易于保證膠囊填充時裝量的穩(wěn)定性，反之，較為困難。據(jù)資料報道［17］，當(dāng)其堆密度在500mg/cm3以上時，易于控制膠囊填充時的裝量穩(wěn)定性。本實驗測定結(jié)果該青錢柳膠囊的堆密度為770mg/cm3，處于理想值的范圍內(nèi)，較容易控制裝量穩(wěn)定性。此外，物料的吸濕性同樣影響到膠囊裝量的穩(wěn)定性，當(dāng)充填物料的含水量越高時，物料顆粒間的相對自由運動則越困難，容易粘結(jié)成塊，影響到膠囊填充時的裝量穩(wěn)定性，一般要求膠囊顆粒的含水量在9%以下［14］。實驗測定的硬膠囊顆粒含水量為6.22%，符合藥典要求，反映出青錢柳硬膠囊的裝量穩(wěn)定性較好。

表1 青錢柳硬膠囊內(nèi)容物的流動性和含水量(n=5)Table 1 The flowability and moisture content of Cyclocarya paliurus capsule contents(n=5)

表2 青錢柳硬膠囊的裝量差異Table 2 The content uniformity of Cyclocarya paliurus capsule

2.1.2 青錢柳硬膠囊的裝量差異 裝量差異是反映膠囊裝量穩(wěn)定性的最直觀指標，根據(jù)國家藥典(2010年版)附錄I L.膠囊劑的要求，膠囊劑的裝量差異限度應(yīng)在標示裝量(或平均裝量)的±10.0%以內(nèi)，超出裝量差異限度的不得多于2粒，并不得有1粒超出限度一倍。參照藥典方法對該青錢柳硬膠囊的裝量差異進行考察，其結(jié)果見表2?？梢钥闯鍪畟€樣品中，裝量差異最大的在4.996%，最小的為0.090%，均在藥典要求的范圍內(nèi)沒有超出差異限度(±10%)，由此可見，該青錢柳膠囊的裝量相對穩(wěn)定，這也與流動性檢測結(jié)果反映出的裝量穩(wěn)定性較好相一致。

2.2 青錢柳硬膠囊對實驗小鼠相關(guān)生理指標的影響

2.2.1 對實驗小鼠血糖和體質(zhì)量的影響 青錢柳硬膠囊對實驗小鼠的血糖和體質(zhì)量的影響結(jié)果見表3。從中可以看出模型組小鼠血糖值遠遠高于正常組小鼠的血糖值，且在沒有給予受試樣品的情況下血糖值一直維持在比較高的水平，模型組小鼠體型消瘦，體質(zhì)量較輕，表現(xiàn)出糖尿病典型的特征。而陽性對照組和青錢柳膠囊不同劑量組的小鼠，其血糖值有顯著的下降，膠囊高劑量組的血糖值下降最為明顯，降到12.4mmol/L，與模型組相比達到了極顯著的水平(p＜0.01)，膠囊中劑量和低劑量組血糖值的下降相對高劑量組稍差，但與模型組相比也達到了顯著水平(p＜0.05)。小鼠體質(zhì)量的變化，以陽性對照組和膠囊高劑量組改善最為明顯，與模型組相比均有極顯著(p＜0.01)的好轉(zhuǎn)。由上述兩個反應(yīng)糖尿病典型特征指標的變化，可以看出，青錢柳膠囊可以良好的控制血糖，改善糖代謝，恢復(fù)病鼠的體質(zhì)量，顯著的改善糖尿病的典型癥狀。

表3 青錢柳硬膠囊對實驗小鼠血糖和體質(zhì)量的影響(n=12)Table 3 Effect of Cyclocarya paliurus capsule on body weight and blood glucose of diabetic mice(n=12)

2.2.2 對實驗小鼠總膽固醇、甘油三酯和肝糖原的影響 青錢柳硬膠囊對實驗小鼠總膽固醇、甘油三酯和肝糖原的影響見表4?？梢钥闯觯Ｐ徒M小鼠的總膽固醇為3.311mmol/L，有明顯的升高，與正常組相比達到極顯著的水平(p＜0.01)，而甘油三酯并無顯著的異常變化。由此可知由STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠，不僅對血糖和體質(zhì)量有明顯的影響，而且還能明顯升高總膽固醇的含量。經(jīng)過給藥治療3周后，與模型對照組相比較，青錢柳膠囊高劑量組和陽性對照組小鼠的總膽固醇水平極顯著下降(p＜0.01)，中劑量組和低劑量組的效果依次減弱。該實驗表明，青錢柳硬膠囊除了對糖尿病小鼠的典型病狀有治療作用外，還可以對其并發(fā)癥總膽固醇的升高具有明顯的控制作用，但對甘油三酯的影響受到模型的限制，并未呈現(xiàn)出明顯影響。

實驗數(shù)據(jù)表明，模型組小鼠的肝糖原含量比正常組有明顯的下降，這可以看出，該模型糖尿病小鼠肝臟糖代謝出現(xiàn)紊亂，糖原合成降低，葡萄糖利用減少，糖異生加強，導(dǎo)致血糖升高。經(jīng)過青錢柳膠囊治療3周后，與模型對照組相比較，青錢柳膠囊高、中劑量組小鼠的肝糖原水平極顯著升高(p＜0.01)，低劑量組的效果相對較弱，陽性對照組變化不顯著，該實驗表明，青錢柳硬膠囊能調(diào)節(jié)糖尿病小鼠肝臟糖代謝，增加肝糖原合成，抑制肝糖異生，從而輔助調(diào)節(jié)小鼠血糖。

表4 對實驗小鼠總膽固醇、甘油三酯和肝糖原的影響(n=12)Table 4 Effect of Cyclocarya paliurus capsule on serum total Cholesterol，triglyceride and hepatic glycogen content levels of diabetic mice(n=12)

2.3 青錢柳硬膠囊對實驗小鼠胰腺組織的影響

實驗小鼠胰腺組織切片的病理圖片見圖1，可以看出，正常組的胰島分布于腺泡之間，排列呈團索狀，邊緣整齊。經(jīng)STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型組小鼠胰島數(shù)目明顯減少，存留的胰島體積小，邊緣不整齊。胰島內(nèi)細胞數(shù)目減少，排列松散，呈不同程度的變性。經(jīng)給藥3周后，陽性對照組的胰島的數(shù)量及每個胰島的面積比模型組明顯增多和增大，胰島細胞變性的程度減輕，細胞排列較模型組致密程度增加。青錢柳硬膠囊高劑量組小鼠的平均胰島數(shù)量、面積較模型組胰島增多，胰島細胞變性程度較模型組減輕，而中、低劑量組的效果較模型組差異不顯著，無明顯改善。

圖1 青錢柳硬膠囊對實驗小鼠胰腺組織的影響Fig.1 Effect of Cyclocarya paliurus capsule on mouse pancreas

3 結(jié)論

綜上，通過上述實驗看出，青錢柳硬膠囊內(nèi)容物的含水量為6.22%，堆密度為770g/cm3，休止角為30.1°，裝量差異最大為4.996%，均在較理想的范圍內(nèi)，表明該硬膠囊的流動性較好，填充易于控制，裝量穩(wěn)定性較好。動物實驗表明該青錢柳硬膠囊可以降低糖尿病小鼠的血糖值和總膽固醇，改善小鼠的體質(zhì)量，保持受試小鼠的肝糖原含量，促進肝糖原恢復(fù)至正常水平，緩解糖尿病的典型病癥。其中高劑量組效果最好，該組小鼠血糖值為(12.4±3.8)mmol/L，體質(zhì)量為(23.8±2.7)g，總膽固醇為(2.479±0.490)mmol/L，肝糖原為(2.949±0.612)mg/g，與模型組比較有極顯著性差異(p＜0.01)。胰腺組織病理切片則也表明青錢柳硬膠囊高劑量組治療后有減輕胰島病變的作用，表現(xiàn)為增加胰島數(shù)目，增大胰島面積，減輕胰島細胞變性程度。

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