黃種新 杜好信 姚成才

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)2006級(jí)本碩連讀研究生 福州 250122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬廈門市中醫(yī)院 廈門 361009）

柴胡對(duì)人食管癌細(xì)胞株Eca-109的抑制作用*

黃種新1杜好信2姚成才2

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)2006級(jí)本碩連讀研究生 福州 250122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬廈門市中醫(yī)院 廈門 361009）

目的：探討中藥柴胡對(duì)人食管癌細(xì)胞株Eca-109的抑制作用。方法：體外培養(yǎng)人食管癌細(xì)胞株(Eca-109)，分別給以不同濃度的柴胡溶液對(duì)體外培養(yǎng)的Eca-109細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)。以MTT比色法測定柴胡溶液對(duì)Eca-109細(xì)胞株的抑制增殖的作用，計(jì)算其細(xì)胞增殖存活率。結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)顯示柴胡溶液可以明顯抑制Eca-109細(xì)胞株的增殖。用藥后Eca-109細(xì)胞增殖存活率下降幅度與劑量呈正相。結(jié)論：中藥柴胡在體外具有抗腫瘤作用，其機(jī)制是抑制腫瘤細(xì)胞增殖，及抑制細(xì)胞的分化而達(dá)到抗腫瘤的目的。

柴胡；食管癌細(xì)胞；抑制作用

柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為傘形科植物，是我國的傳統(tǒng)中藥和常用中藥，其性味苦涼，有疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉氣之功效。用于治療寒熱往來、胸滿脅痛、口苦耳聾、頭痛目眩等[1]。柴胡主要成分為柴胡皂苷（saikosapoins a、b、c、d 四種）、甾醇、揮發(fā)油、脂肪酸和多糖等。有文獻(xiàn)報(bào)道了有關(guān)柴胡皂苷抗腫瘤作用的研究成果[2]。本研究以人食管癌Eca-109細(xì)胞為材料，觀察中藥柴胡對(duì)這種細(xì)胞株生長的影響作用。旨在探索柴胡對(duì)人食管癌細(xì)胞株的抑制作用，為進(jìn)一步研究其抑制作用及指導(dǎo)臨床實(shí)踐提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人食管癌細(xì)胞株Eca-109，購自上海細(xì)胞庫。

1.2 主要化學(xué)試劑 MTT購置于Sigma公司，胎牛血清購置于杭州試劑生物工程材料有限公司，青霉素購置于廈門泰京有限公司。

1.3 儀器 培養(yǎng)箱（REVCO）、酶聯(lián)免疫檢測儀（KHB）、高速離心機(jī)、普通離心機(jī)、XHQ-A型旋渦混合器、DK-8D型電熱恒溫水箱、UNO-II型PCR擴(kuò)增儀（Biemetra）、DYY-IIITB 型水平電泳儀、DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、流式細(xì)胞儀、隔水式電熱恒溫箱、震蕩混勻器、恒溫干燥箱等。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌細(xì)胞株Eca-109在10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代，傳代時(shí)吸除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗兩次，0.5 mL 0.25%胰酶進(jìn)行消化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將細(xì)胞接種于不同規(guī)格的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。將柴胡溶液溶于未加胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，配制成0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的濃度用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞增殖存活率測定（MTT法） 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/L，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL(每孔5×103個(gè)細(xì)胞)；細(xì)胞接種24 h后，開始加入藥物進(jìn)行處理（不同濃度）；每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸除MTT溶液，每孔加入150 μL的DMSO；脫色搖床搖動(dòng)10 min后，酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm時(shí)各孔OD值；根據(jù)公式：細(xì)胞抑制率=（OD對(duì)照組－OD給藥組）/OD對(duì)照組×100%計(jì)算出各組細(xì)胞的增殖存活率。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Origin7.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以(±S)表示，進(jìn)行單因素方差分析及其他相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用MTT法測定Eca-109經(jīng)不同濃度中藥柴胡溶液（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）處理 24 h后的細(xì)胞增殖存活率。從表1結(jié)果可以看出，與對(duì)照組相比，不同濃度柴胡溶液組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Eca-109在0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的柴胡溶液作用 24 h 后其細(xì)胞增殖存活率呈明顯的遞減趨勢。說明柴胡溶液在體外對(duì)Eca-109具有明顯的存活抑制作用，它們的增殖存活率與柴胡溶液呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

表1 不同濃度柴胡溶液處理24 h后的Eca-109增殖存活率 (±S) %

表1 不同濃度柴胡溶液處理24 h后的Eca-109增殖存活率 (±S) %

組別 Eca-109增殖存活率 P值對(duì)照組0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 1.5 mg/mL 2.0 mg/mL 100 75.56±7.30 57.74±10.51 55.95±12.40 26.35±6.55＜0.05＜0.05＜0.01＜0.01

4 討論

食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。全世界每年有20余萬人死于食管癌，我國每年死亡達(dá)15萬人，占據(jù)世界食管癌死亡人數(shù)的大部分。在我國，食管癌發(fā)病率男性居各種惡性腫瘤第四位，女性為第七位，而死亡率男女均居第四位。盡管國內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者經(jīng)過幾十年的探索實(shí)踐，在食管癌的防治方面取得很大的成績，但食管癌的具體發(fā)病機(jī)制仍然不十分清楚，以手術(shù)、化療、放療為主的綜合治療手段仍不盡如人意，尤其在藥物治療方面，食管癌對(duì)化療藥物敏感性很差，化療效果有限，食管癌的預(yù)后仍較差。當(dāng)前的研究顯示，食管癌缺乏對(duì)各種常見抗腫瘤藥物的敏感性，導(dǎo)致其化療的療效低下。近年來，由于分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，各種分子靶點(diǎn)治療藥物的開發(fā)研究猶如雨后春筍，令包括食管癌在內(nèi)的惡性腫瘤防治研究展現(xiàn)出新的活力。本研究證實(shí)中藥柴胡在體外具有抗腫瘤作用，為未來開發(fā)出相關(guān)新的、效果明顯的食管癌化療藥物或者新的輔助化療藥物提供理論基礎(chǔ)。

國內(nèi)外學(xué)者也對(duì)柴胡的抗腫瘤作用做了臨床和實(shí)驗(yàn)研究。陳靜波等[3]、夏薇等[4]通過給予不同濃度的柴胡皂苷d(SSd)分別作用于HL-60細(xì)胞以及K562細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，SSd對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系；Chiang等[5]研究發(fā)現(xiàn)SSd通過激活Caspase(胱門冬蛋白酶)3和7，引起多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶(po1y-ADP-ribose-po1ymerase,PARP)的分裂從而誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡。Hsu等[6～7]發(fā)現(xiàn)SSd對(duì)引起細(xì)胞凋亡的受體Fas和Fas配體的表達(dá)均有明顯的促進(jìn)作用，可引起G1期細(xì)胞的堆積。劉殿菊等[8]應(yīng)用血清藥理學(xué)方法在體外證實(shí)了柴胡含藥血清的抗腫瘤活性。

本研究結(jié)果顯示：柴胡溶液對(duì)Eca-109細(xì)胞有明顯的抑制作用，且與劑量相關(guān)，柴胡溶液的抑制作用隨濃度增加而增加(P＜0.05)。說明柴胡溶液在體外對(duì)食管癌細(xì)胞的生長增殖有明顯的抑制作用，有可能是一種有希望的抗癌中藥。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，必將對(duì)中藥柴胡及類似藥物抗腫瘤抑制作用的研究起到很大的推動(dòng)作用，針對(duì)這些機(jī)制的研究有希望開發(fā)出新型的抗腫瘤藥物。

[1]李家邦.中醫(yī)學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006.138-139,223

[2]王艷麗,和水祥,羅金燕.柴胡皂苷抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2006,1(4):98-100

[3]陳靜波,夏薇,崔清潭.柴胡皂甙d(SSd)對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2001,2(6):486-488

[4]夏薇,崔新羽,崔清潭.柴胡皂甙d(SSd)對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制作用[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2002,3(2):113-115

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[8]劉殿菊,關(guān)霞.柴胡含藥血清的體外抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2011,12(2):76-77

Objective:To investigate the inhibitory effect of Radix Bup1euri on human esophagea1 cancer ce11 Eca-109.Methods:In vitro cu1ture of human esophagea1 cancer ce11(Eca-109),were treated with different concentration of RadixBup1eurum so1ution on Eca-109 in vitro intervention.Inhibition of pro1iferation was measured Radix with MTT co1orimetric method,to ca1cu1ate the ce11 pro1iferation,surviva1 rate.Resu1ts:MTT showed Bup1eurum so1ution can significant1y inhibit the pro1iferation of Eca-109 ce11s.After the pro1iferation of Eca-109 ce11 surviva1 rate decreased with the dose of positive.Conc1usion:Radix Bup1euri has antitum or effect in vitro,the mechanism is to inhibit the pro1iferation of tumor ce11s,and inhibited ce11 differentiationand achieve the purpose of anti tumor.

Radix bup1euri;Esophagus carcinoma ce11;Inhibition

福建廈門市科技局科研項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：3502Z20077064)

R 285.5

B

10.3969/j.issn.1671-4040.2013.04.058

2013-03-13）